微生物限度检查法标准操作规程

微生物限度检查法标准操作规程

一、目的：建立微生物限度检查的基本操作规程，为微生物检查人员提供正确的操作规程。

二、适用范围：适用于品管化验室的微生物限度检查。

三、职责：品管微生物检验员对本标准的实施负责。

四、正文：

1 定义：微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。

2 实验用具：

电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm 波长）。

3 培养基：

3.1 营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、乳糖胆盐培养基、蛋白胨水培养基。

3.2 培养基的管理、配制应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配制规程。

4 试液：甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。

5 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液。

6 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10 浓度的供试品溶液。

7 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）441022]。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1 白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20 小时，稀释至1：106，对照菌的加入量为50-100 个。

8 检查法：

8.1 除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为

25-28℃，控制菌的培养温度为35±1℃。

8.2 细菌、霉菌计数：

8.2.1 平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103 等适宜的稀释级。分别取连续三级10 倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm 的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，等凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2~3 个平皿。

营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。

8.2.2 菌数测定阴性对照试验取供试验用的稀释剂各1ml，置4 个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。

8.2.3 细菌培养时间为48 小时，分别在24 小时及48 小时点计菌落数，一般以48 小时菌落数为准，霉菌培养时间为72 小时，分别在48 小时及72 小时点计菌落数，一般以72 小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。

8.2.4 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

8.2.5 菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30-300 之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100 之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。如只有1 个稀释级菌落数在30-300（30-100）

之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有两个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。

比值=低稀释级平均菌落数稀释倍数

高稀释级平均菌落数稀释倍数

.当比值≤2 时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2 时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有3 个稀释级的平均菌落数均在30-300（30-100）之间时，以后两个稀释级计算级间比值，如各稀释级的平均菌落数均不在30-300（30-100）之间，以最接近30 或300 的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告，如各

稀释级平均菌落数均小于30 时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如当1：10（1：100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1：10）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。

8.2.6 培养基稀释法：取供试液（原液或1：10 供试液）3 份，每份各1ml，分别注入5 个平皿内（每皿各0.2ml）每个平皿中倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后倒置培养，计数，每1ml 注入的5 个平板点计的菌落数之和即为每1ml 的菌落数，共得3 组数据，以3 份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。

如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1 时，则报告菌数为小于10 个。

8.3 控制菌检查除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验等项检查。

8.3.1 大肠菌群：

8.3.1.1 检样稀释及培养

①以无菌操作，将检样25g（ml）放于含有225ml 灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇或研磨做成1：10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好在均质器中以8000—10000r/min 的速度处理1min，作成1：10 的均匀稀释液。

②用1ml 灭菌吸管吸取1：10 稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖不要接触管内稀释液），混合均匀，做成1：100 的稀释液。

③另取1ml 灭菌吸管，按上述操作顺序，做10 倍递增稀释液。如此每次递增稀释一次，即换用一支1ml 灭菌吸管。

④根据食品卫生标准要求或标本污染情况的估计，选择3 个合适的稀释度，每个稀释度接种三管。

8.3.1.2 乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml 以上者，用双

料乳糖胆盐发酵管，

1ml 及1ml 以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

8.3.1.3 分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

8.3.1.4 证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

8.3.1.5 报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN 检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN 值。

9 结果判断：

9.1 细菌菌落数、霉菌菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下的规定，应判为供试品符合规定；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不符合规定。

9.2 细菌菌落数、霉菌菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。

9.3 如营养琼脂培养基平板上生长霉菌菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，经复试2 次，如3 次结果平均值仍超过规定，应判为供试品不符合规定。

9.4 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按第一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不符合规定。