原代肿瘤细胞的分离培养

原代肿瘤细胞的分离培养

实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞

实验器材：新鲜人体乳腺癌组织

胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×）

手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱

实验原理：

酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。

本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。实验步骤：

1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的

血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。

2.将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3

大小的碎块。

3.转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。

4.将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于３

７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min于镜下观察一次。

5.待组织块镜下透光性良好，呈絮状时，转入15ml离心管中，1300r/min离心5min，弃上

清。

6.加入PBS洗涤数次，反复吹打后，1300r/min离心5min，弃上清。

7.加入DMEM完全培养基（含1×双抗），反复吹打，转入培养皿中，镜下可见单个细胞

及细胞团，细胞培养箱培养。

注意事项：

1.全程严格无菌操作。

2.取材要注意新鲜和保鲜。

3.取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，尽可能减少对细胞的机械损伤，切碎组织时

应避免组织干燥。

4.若组织在消化时间较长时仍未散开，可采用多次提取消化法以减少酶对已消化下来的细

胞的损伤。

活细胞工作站分析技术

一、本显微镜主要观察方法简介

明场：适合常规镜检、病理、染色样品的观察方法。此观察方法优点是视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单。缺点是：透明标本对比度低，标本没有立体感。

相差：利用被检物体的光程（折射率x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。鉴定活体细胞最实用、最经济的方法。

荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。荧光显微镜利用荧光光源激发样品中的荧光物质，检测激发光的情况

以上各种观察方法配合活细胞孵育装置，即可完成对活细胞的各种观察要求。活细胞孵育装置通过软件或TFT触摸屏中Incubation模块进行精细的调节。

二、系统开关机

开机顺序

1.打开显微镜电源总开关

2.打开显微镜开关

3.拍荧光时打开荧光光源

4.打开电脑及软件

关机顺序

先关软件，然后是荧光光源、显微镜开关、电源开关！！

三、明场观察成像操作流程

1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑

2. 打开卤素灯的光闸“TL” 使光线透过聚光镜穿透样品

3. 调节光强，光路100%转到眼睛

4. 聚光镜打到H 位

5. 反射镜转轮打到BF明场位置

6. 低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，然后再调至高倍

7. 准备拍照了，首先光路切换至相机

8. 打开软件，点开Live 按钮

9. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——如果彩色模式

拍照需要做自动或互动式白平衡（White balance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save

10. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑

四、相差观察成像操作流程

1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑

2. 打开卤素灯的光闸“TL” 使光线透过聚光镜穿透样品

3. 调节光强，光路100%转到眼睛

4. 聚光镜根据物镜后面的Ph标注打到Ph 1/ Ph 2 或Ph3位

5. 反射镜转轮打到BF位

6. 低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，进而转到高倍，根据个人不同需求

7. 准备拍照了，首先光路切换至相机

8. 打开软件，点开Live 按钮

9. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——彩色模式下做

白平衡——再次曝光后——Snap成像——保存Save

10. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑

五、荧光观察成像操作流程

1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”)，荧光光源，孵育装置及电脑

2. 先按明场或相差观察方法找到阳性信号

3. 关闭卤素灯光闸”TL”，打开荧光灯光闸“RL”

4. 反射镜转轮根据标记探针的颜色打到GFP，Rhod或DAPI

5. 准备拍照了，首先光路切换至相机

6. 打开软件，点开Live 按钮

7. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——Snap成像——

保存Save

8. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑

六、活细胞时序连拍流程

时序模块可用于获取一定时间内的一系列图像，如活细胞长时间的观察和拍摄，生成的图像就是一个时间序列，可用于分析随时间变化的过程。

1.首先放好样品，调好曝光时间和焦距。

2.恒温孵育装置的各参数通过软件调节，在工作区找到Incubator可以对活细胞的环境条件：

温度，CO2- 或O2的浓度进行精细调解。

3.在工作区激活Multidimensional Acquisition下的属性页。

4.在Experiment属性页选择Time lapse功能。

5.输入需要的时间间隔，例如2分钟。时间单位可以从下拉菜单中选择。

6.然后输入想要获取的图像数目（# Cycles）。从这两个数字可以计算出总的实验时间。

7.用户也可以输入时间间隔和总的持续时间，系统会自动计算图像数目。选择需要计算的

功能，也可以直接在输入区输入数值，然后单击键进行计算。

8.单击start开始取图。取图进度通过一个进度条显示。单击Cancel即可取消取图。

9.生成的图像显示在图像区，在这里可以用播放器对它进行操作。该图象还未被保存，这

时可以看见图象名字是*号。最后保存或者导出图象即可完成一份时序连拍图。

肿瘤干细胞分选与鉴定技术

原理