原代肿瘤细胞的分离培养
原代细胞培养过程
原代细胞培养过程细胞是生命的基本单位，是构成生物体的基本组成部分。
细胞的研究对于生命科学的发展具有重要的意义。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的未经过传代的细胞，具有较高的生物学活性和生物学特性，是细胞学、生物学、医学等领域的重要研究对象。
原代细胞培养是将原代细胞在体外培养的过程，是细胞学研究的重要手段之一。
原代细胞培养的目的原代细胞培养的主要目的是为了研究细胞的生物学特性、生长和分化规律、细胞信号传导、细胞凋亡、细胞周期等方面的问题。
同时，原代细胞培养还可以用于药物筛选、毒性测试、细胞治疗等方面的研究。
原代细胞培养的步骤原代细胞培养的步骤主要包括细胞分离、细胞培养、细胞传代等。
1. 细胞分离细胞分离是将组织或器官中的细胞分离出来的过程。
常用的细胞分离方法有机械分离、酶消化、胶原酶消化等。
其中，酶消化是最常用的方法之一。
酶消化可以使细胞间的胶原纤维、基质等物质被消化，从而使细胞分离出来。
酶消化的时间和酶的浓度需要根据不同的组织和细胞类型进行调整。
2. 细胞培养细胞培养是将分离出来的细胞在体外培养的过程。
细胞培养需要提供适宜的培养基、培养条件和培养器具。
培养基是细胞培养的基础，包括营养物质、生长因子、激素等。
培养条件包括温度、湿度、氧气浓度、CO2浓度等。
培养器具包括培养皿、培养瓶、细胞培养箱等。
3. 细胞传代细胞传代是将原代细胞在体外培养的过程中，将细胞分离并继续培养的过程。
细胞传代的次数越多，细胞的生物学特性和生物学活性就越低。
因此，在进行原代细胞培养时，需要根据实验的需要和细胞的特性来确定细胞传代的次数。
原代细胞培养的注意事项1. 细胞分离时需要注意细胞的完整性和活性，避免对细胞造成损伤。
2. 细胞培养时需要注意培养基的配制和培养条件的控制，避免对细胞造成不良影响。
3. 细胞传代时需要注意细胞的生长状态和细胞的传代次数，避免对细胞造成不可逆的影响。
4. 细胞培养过程中需要注意细胞的无菌性和培养器具的消毒，避免细胞被细菌、真菌等微生物污染。
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。
然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。
因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。
然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。
第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。
这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。
原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。
所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。
第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。
主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法是指将从活体组织中分离出的未经连续传代或只进行过有限传代的原代细胞，在无菌条件下进行体外培养的技术。
以下是一般的原代细胞培养方法：
1. 组织分离：从生物体中取得需要培养的组织，如肺、肾等。
将组织切碎或用酶消化等方法进行细胞的分离。
2. 细胞悬浮液制备：将分离得到的细胞以适当的培养基和缓冲液混合，形成细胞悬浮液。
3. 培养基准备：根据细胞类型的不同，选择适当的培养基，并添加必要的营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 培养皿涂层：将培养皿表面涂覆一层适当的基质，如胶原、明胶等，以促进细胞附着生长。
5. 细胞接种：将细胞悬浮液均匀地加入培养皿中，使细胞附着在培养皿表面。
6. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，控制适当的温度、湿度和气体组成等条件，提供细胞正常生长所需的环境。
7. 培养液更换：定期更换培养液，补充必要的营养物质和生长因子，以保持细胞的生长和增殖。
8. 细胞观察和记录：定期观察和记录细胞的形态、增殖情况和细胞数量等，评估细胞的健康状态。
需要注意的是，不同类型的细胞可能有特定的培养要求，如培养
基成分、pH值、气体组成、温度和湿度等。
因此，在进行原代细胞培养时，应根据具体的细胞类型和研究目的，选择合适的培养条件和方法。
肿瘤原代血管内皮细胞提取
肿瘤原代血管内皮细胞提取
肿瘤原代血管内皮细胞提取是指从肿瘤组织中分离和培养原代血管内皮细胞。
下面是一种常见的方法：
1. 收集肿瘤组织样本：从患者手术切除的肿瘤组织或者小鼠移植的肿瘤样本中切取一小块组织。
2. 组织消化：将切取的肿瘤组织块放入含有酶消化液（如胰酶、胶原酶等）的培养皿中，静置一段时间（通常为30分钟至1
小时），使组织细胞分解。
3. 细胞收集：将消化后的组织液过筛或通过离心的方法分离细胞。
离心后，上清液中包含了原代血管内皮细胞。
4. 细胞培养：将分离得到的原代血管内皮细胞接种于预先涂覆了基质的培养皿中。
培养基可以选择适合血管内皮细胞生长的培养基，如内皮细胞培养基。
5. 细胞培养与扩增：将培养皿置于恒温培养箱中，提供适当的培养条件（如37℃恒温、5% CO2、高湿度等），定期更换培
养基，并观察细胞生长情况。
原代内皮细胞通常需要经过数代扩增，以获得足够量的细胞。
以上是一种常见的肿瘤原代血管内皮细胞提取方法，具体操作细节可能根据实验目的和实验室条件的不同而有所调整。
肿瘤细胞分离培养(1)
肿瘤细胞分离培养操作流程1.准备好动物试验台。
提供无菌环境当然是最好的。
2.将一个10cm培养皿（无菌）置入操作台中，用来盛放肿瘤，放在冰上。
3.麻醉小鼠。
推荐异氟烷，因为它对代谢的影响最小。
4.腹部向上将小鼠固定于工作平台上；胶带或大头针固定四肢。
为尽量减少因痛苦导致的麻醉动物过早苏醒，胶带是首选。
5.彻底清洁腹部和胸部区域，用乙醇或碘剂消毒。
此步骤既要求迅速又要求消毒彻底，因为动物的毛皮是第一个潜在的污染源。
如果动物有排便，一定要清理和消毒沾染粪便的区域。
（有文献建议断食12h）6.准备好所有必要的试剂。
7.主要实验材料：Defined K-SFM 无血清培养基、Ⅱ型胶原酶或胰蛋白酶、RPMI 1640、PBS，EGF（表皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维生长因子），青霉素和链霉素以及两性霉素B（0.25 mg / ml）。
8.最好在无菌环境中分装胶原酶，轻柔涡旋，并在37℃环境下使胶原酶溶解30-60分钟。
注意，虽然胶原酶溶解迅速，充分溶解30分钟以上的胶原酶具有更加稳定的消化效率（基于细胞总产量）。
9.用含青霉素及链霉素的RPMI 1640反复冲洗并剔除坏死组织后，在培养皿内用无菌剪刀反复剪切成约1 mm 3 大小的组织块。
10.收集剪切后的肿瘤组织置于底面积为25 cm 2的培养瓶中，用含有Ⅱ型胶原酶200-400 U/mL的Defined K-SFM 无血清培养基在5%的CO 2培养箱中37 ℃消化2h-3 h后，当大多数组织变成细胞悬浮液时，酶消化停止。
倒置显微镜下观察大部分细胞为单个细胞。
11.用RPMI 1640洗涤，300g离心5min，1-3次彻底去除胶原酶。
收集消化后的肺癌细胞。
12.用含EGF 20 ng/mL、bFGF10 ng/mL 的Defined K-SFM培养基悬浮细胞并转移到25 cm 2的培养瓶中，在5%的CO 2培养箱中37 ℃培养，（有文献报道建议先用有血清培养4h后换成无血清培养基，以便保持细胞形态）。
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事项
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事
项
细胞原代培养也被称为组织块培养法，是一种从组织中分离和培养原代细胞的方法。
以下是细胞原代培养的实验步骤和注意事项：
1.组织分离：首先需要从生物体中收集组织样本，如肝、肺、心脏等。
样本需要通过消化或机械分离等方法分离出单个细胞或小组织块。
消化方法可以使用胰酶或胰蛋白酶等酶类来消化样本，机械分离则需要使用切割器或剪刀等工具。
2.细胞培养：分离出的组织块需要在含有营养物质和生长因子的培养基中培养。
在培养过程中需要注意不要过度培养，否则会导致细胞老化或死亡。
3.传代：当细胞达到一定密度时，需要将其分离并移至新的培养皿中进行传代，以维持细胞的生长和繁殖。
注意事项：
1.细胞的培养需要在严格的无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.选择适当的培养基和生长因子，以保证细胞的生长和分化。
3.细胞培养过程中需要定期观察细胞的形态和生长情况，以及细胞浓度，以便及时进行传代。
4.细胞应该在体外保持与体内相似的环境和温度，以提高细胞的存活和生长率。
5.尽量使用新鲜的组织样本，避免长时间冷藏或保存，以保证细胞质量和数量的优良。
原代肿瘤细胞的分离培养
原代肿瘤细胞的分离培养实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞实验器材：新鲜人体乳腺癌组织胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×）手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱实验原理：酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。
胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。
本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。
实验步骤：1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。
2.将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3大小的碎块。
3.转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。
4.将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于３７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min于镜下观察一次。
原代细胞分离方法及原理
原代细胞分离方法及原理嘿，咱今儿就来唠唠原代细胞分离的那些事儿！你知道不，原代细胞那可是生物学研究里的宝贝呀！先来说说酶消化法吧。
这就好比是给细胞来一场温和的“拆解行动”。
通过特定的酶，把组织慢慢地分解开来，让细胞们能一个个地“蹦跶”出来。
就好像是把一个大拼图慢慢地拆成小块，然后把那些我们想要的小拼图挑出来。
是不是挺神奇的呀？这种方法就像是一把精巧的钥匙，能打开细胞世界的大门呢！还有组织块培养法，这可有意思啦！把小小的组织块直接放到培养皿里，就像是给细胞们安了个家。
然后呢，细胞们就会自己慢慢地从组织块里迁移出来，开始它们的“新生活”。
这不就像是一颗种子，只要给它合适的环境，它就能生根发芽嘛！机械分离法呢，就像是个大力士，用一些简单粗暴的手段把细胞给弄出来。
虽然简单直接，但也得小心别伤着了那些娇贵的细胞哟！那为啥要搞这些原代细胞分离呢？这可太重要啦！就好比你要盖一座大楼，原代细胞就是那最基础的砖块呀！只有有了这些高质量的原代细胞，我们才能更好地研究细胞的各种特性，探索生命的奥秘呀！你想想，如果没有这些分离方法，我们怎么能深入了解细胞的行为和功能呢？那不就像是在黑暗中摸索，啥都看不清嘛！这些方法让我们能清楚地看到细胞的“一举一动”，就像给我们配上了一副神奇的眼镜，让我们能看清细胞世界的精彩。
而且哦，不同的方法都有它们各自的优缺点呢！酶消化法可能会比较温和，但要是酶用得不对，那可就麻烦啦！组织块培养法虽然简单，但需要耐心等待细胞们慢慢地“搬家”。
机械分离法快捷，但得掌握好力度呀！所以说呀，搞原代细胞分离可真是个技术活，得细心、耐心，还得有足够的专业知识。
这可不是随随便便就能搞定的事儿呢！咱再回过头来想想，要是没有这些分离方法，我们的生物学研究得落后多少呀！那好多疾病的研究、药物的开发不都得受影响嘛！总之呢，原代细胞分离方法及原理那可是生物学领域里的重要宝藏呀！咱可得好好掌握它们，让它们为我们的科学研究和人类健康服务哟！你说是不是这个理儿呢？。
原代细胞分离方法
原代细胞分离方法
原代细胞分离主要有两种方法：机械分散法和消化分离法。
机械分散法适用于纤维成分很少的脑组织、部分胚胎组织等。
具体步骤如下：
1. 将组织剪碎至1mm3的组织块。
2. 用PBS清洗两次，然后用吸管吹打分散组织细胞，或把已充分剪碎分散
的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
3. 收集细胞转入离心管中，以1000rpm/分钟离心5分钟。
4. 去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
消化分离法适用于细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
具体步骤如下：
1. 用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
2. 加入%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
次日再用Hanks液洗涤，弃去
上清，共洗2-3次。
3. 加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
以上是原代细胞分离的两种主要方法，可以根据实际需求和实验条件选择合适的方法进行操作。
原代滋养层细胞的分离培养及鉴定
一、概述原代细胞是从组织或器官中分离得到的未经过传代培养的细胞，通常被用于研究细胞的特性和生物学行为。
在细胞生物学研究中，原代细胞的分离、培养及鉴定是非常重要的步骤，它们可以为科学家提供更加真实的细胞生理功能和反应。
本文将讨论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定方法。
二、原代滋养层细胞的分离1. 准备工作在进行原代滋养层细胞的分离前，先准备必要的材料和试剂，包括消毒器械、胰酶、培养基和培养皿等。
2. 组织样本的处理将所需的组织样本取出并进行消毒处理，然后用无菌工具将其切割成小块。
3. 酶解和分离将组织样本块放入含有适量胰酶的培养基中，进行酶解和振荡分离，以获得细胞悬浮液。
4. 细胞分离通过离心等方法，将细胞悬浮液离心沉淀，然后将上清液中的细胞转移到新的培养皿中。
三、原代滋养层细胞的培养1. 培养基的准备根据原代滋养层细胞的类型和特性，选择适当的培养基，并添加相应的生长因子和营养成分。
2. 细胞的培养条件将分离得到的原代滋养层细胞接种于含有培养基的培养皿中，放置在恒温培养箱内，保持适当的温度和湿度条件，定期更换培养基。
3. 细胞的观察和维护利用显微镜观察细胞的生长情况和形态特征，定期对细胞进行传代培养，确保细胞的健康和稳定生长。
四、原代滋养层细胞的鉴定1. 形态学鉴定采用显微镜观察细胞的形态特征，包括大小、形状、胞浆及核的结构等，与已知的细胞形态进行比对鉴定。
2. 免疫细胞化学鉴定利用免疫细胞化学染色技术，检测细胞内特定蛋白的表达情况，例如细胞信号分子或细胞骨架蛋白等，来确定细胞的类型和特性。
3. 分子生物学鉴定通过PCR、Western blot等分子生物学技术，检测细胞内特定基因的表达情况，以确定细胞的遗传特性和分子水平特征。
五、结论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定是细胞生物学研究中的重要环节，操作规范和技术熟练对于获得高质量的原代细胞至关重要。
只有通过严格的分离和培养条件，并结合形态学、免疫细胞化学及分子生物学鉴定等手段，才能得到真实、可靠的实验结果，并为细胞生物学研究提供可靠的资料。
肿瘤细胞原代培养
肿瘤细胞原代培养肿瘤细胞原代培养是一项重要的实验技术，用于研究肿瘤细胞的生物学特性以及开展抗肿瘤药物的筛选和评估。
本文将介绍肿瘤细胞原代培养的基本原理、操作步骤以及应用前景。
一、基本原理肿瘤细胞原代培养是将从患者体内获得的肿瘤组织分离、培养和传代的过程。
首先，通过手术或穿刺等方式采集到肿瘤组织，将组织切割成小块或将细胞分散成悬浮液。
然后，将组织块或细胞悬浮液接种到含有适当培养基和培养液的培养皿中。
在适宜的培养条件下，肿瘤细胞会依次附着、扩增和形成克隆，形成原代培养物。
原代培养物可经过传代，得到连续的肿瘤细胞株。
二、操作步骤1. 组织采集：使用无菌器械采集新鲜的肿瘤组织，尽量避免污染和损伤。
2. 组织处理：将组织切割成小块或细胞分散成悬浮液，使用胰酶等消化酶加速细胞的分散。
3. 培养基配制：根据具体需要，配制适当的培养基，包括营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 细胞接种：将组织块或细胞悬浮液接种到培养皿中，控制接种密度和培养皿的表面涂层，有利于细胞的附着和生长。
5. 培养条件：保持培养皿内的适宜温度、湿度和气体环境，提供充足的营养物质和生长因子，促进细胞的增殖和分化。
6. 细胞观察：定期观察细胞的形态、增殖情况和污染情况，记录生长曲线和细胞倍增时间。
7. 传代培养：当细胞达到一定密度时，用胰酶等消化酶将细胞从培养皿中解离，重新接种到新的培养皿中，继续培养。
三、应用前景肿瘤细胞原代培养是肿瘤研究和药物筛选的重要工具。
通过原代培养，可以获取患者个体的肿瘤细胞，研究其生物学特性、毒性反应、侵袭和转移能力等。
同时，原代培养还可用于筛选和评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用，为临床治疗提供参考。
肿瘤细胞原代培养还可应用于肿瘤干细胞的研究。
肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，是肿瘤发生、发展和耐药性的关键因素。
通过原代培养，可以分离和培养肿瘤干细胞，研究其特性和调控机制，为肿瘤干细胞治疗提供理论和实验基础。
肿瘤细胞原代培养是一项重要的实验技术，具有广泛的研究和应用价值。
原代细胞提取步骤
原代细胞提取步骤1.确定实验目的：首先需要明确实验目的，例如提取和培养肿瘤细胞、蛙卵或小鼠胚胎。
2.选取适当的生物材料：确定需要提取细胞的生物体，选择适当的生物材料，如动物组织、器官或细胞系。
3.准备培养基和试剂：根据实验目的，准备适当的培养基，如DMEM、RPMI-1640或F12培养基，以及所需的试剂和溶液，如胰酶和胆汁盐、PBS缓冲液、抗生素和抗菌剂。
4.杀死生物体并取出组织或器官：采取适当的方法杀死生物体，如禁食、麻醉或使用麻醉剂和杀菌剂。
然后，使用消毒的手术器械，如手术刀或剪刀，将组织或器官剖开。
5.分离组织或器官：将组织或器官从生物体中分离出来。
这可能需要研磨、离心或过滤等方法。
在这一步骤中要注意避免外部因素的污染，如尘埃、细菌和其他细胞。
6.细胞培养：将分离出的组织或器官放入含有预先准备好的培养基的培养皿或培养板中。
培养基中通常含有生长因子、维生素和其他必需的营养物质。
7.组织或器官的细胞释放：如果需要提取的是组织或器官中的细胞，可以使用胰酶和胆汁盐等消化酶，使组织或器官中的细胞分离。
这些消化酶可使细胞表面分子解离，从而使细胞更容易分离。
8.细胞的筛选和分离：将培养皿或培养板中的细胞进行筛选和分离，以获取所需的细胞。
可以使用免疫磁珠、细胞排序、细胞分选仪或显微操作等方法。
9. 细胞存活性检测：可以通过尝试性培养或使用染色剂如Trypan蓝来检测分离出的细胞的存活性。
存活的细胞可以进一步培养或进行其他实验。
10.细胞的培养和扩增：将分离出的细胞放入新的培养皿或培养板中，供其在培养基中继续生长和扩增。
根据需要，可以提供适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度。
11.细胞的保存和冻存：如果需要保存或冻存细胞，可以使用冷冻保存液如DMSO（二甲基亚砜），将细胞储存于低温环境中。
总结起来，原代细胞提取涉及到生物体杀死、组织或器官分离、细胞培养和细胞分离等步骤。
这些步骤需要精确、细致地操作，以确保提取到的细胞是纯净和活力良好的。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。
组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。
2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。
酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。
3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。
传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。
可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。
2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。
3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。
选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。
4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。
在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。
注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。
2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。
3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。
必须确保这些条件处于合适的范围内。
4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。
过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。
5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。
6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。
细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。
遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。
原代细胞的分离与培养实验怎么做？
原代细胞的分离与培养实验怎么做？
原代细胞是出了名的难养，对培养环境和实验操作的要求更苛刻。
原代细胞在体外通常只能传代少数几次，某些原代细胞（如神经元细胞）甚至无法进行传代。
对于研究人员来说，如何才能经济高效地培养好原代细胞，并围绕这有限几次传代的细胞设计实验，是更大的一个挑战。
原代细胞是取材于切除的动物组织，通过酶处理，在适当的条件下培养直至达到足够的数量。
分离的原代细胞有两种类型：贴壁细胞（锚定依赖性生长）和悬浮细胞（锚定非依赖性），贴壁细胞多来自器官组织，而悬浮细胞多来自血液系统的细胞。
从组织制备原代细胞，即使捱过了极其严苛的解离步骤，不严谨的分离操作可能会导致细胞生长缓慢、表型不一致甚至细胞污染，特别是由于组织中可能含有细菌等微生物，污染问题对于原代细胞的分离和培养是一个很大的隐患。
而为了让研究人员不再为这些问题头疼，现在已经出现了一些细胞公司可供应现成的原代细胞，并对应配有充分优化的培养基和实验方案，这使得原代细胞的培养和研究比以往要轻松得多。
而对于具备自主从组织中获取原代细胞的实验室，也建议以商业化的原代细胞作为对照，采用均一性和稳定性更好的P2/P3代次进行实验，并用专门的原代细胞培养基进行培养，最大限度提高原代细胞的生长。
原代细胞培养步骤
原代细胞培养步骤
原代细胞培养步骤如下：
1. 准备：消毒培养用品，安装吸管帽。
2. 处理组织：漂洗组织块，去除血污。
3. 剪切：用手术刀将组织切成若干小块。
4. 消化：用胰蛋白酶液消化，加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液。
5. 分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化。
6. 计数：用计数板计数，对大多数细胞来说，pH需要控制在
7.2-7.4范围内。
7. 培养：置于37℃的CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布棉塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
注意，原代细胞的培养得保证无菌环境，并且细胞生长所需要的营养成分得充足。
肿瘤组织源性原代细胞分离和培养
肿瘤组织源性原代细胞分离和培养
肿瘤组织源性原代细胞分离和培养
肿瘤组织源性原代细胞分离的常用方法：
组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法。
肿瘤组织源性原代细胞对药物筛选体系的益处：
（1）肿瘤组织源性原代细胞培养需要的肿瘤组织较少;
（2）不影响其他病理检查对肿瘤标本的需求；
（3）肿瘤组织源性原代细胞培养可完成多种化疗药敏评价；
（4）肿瘤组织源性原代细胞可评估药物的耐药性；
（5）肿瘤组织源性原代细胞实验结果成功评价率高于90－95％；（6）肿瘤组织源性原代细胞具有很好的结果重复性；
（7）肿瘤组织源性原代细胞体外实验结果与药物体内疗效有很好的符合率；
（8）肿瘤组织源性原代细胞与个体化治疗的应用有很好的相关性；（9）肿瘤组织源性原代细胞符合肿瘤细胞的生物学和遗传学特性完全一致。
原代细胞培养注意事项
原代细胞培养注意事项
原代细胞培养是一种非常重要的实验技术，它可以用于研究细胞的生长、分化、代谢等方面。
但是，原代细胞培养也有一些注意事项需要我们注意，下面就来详细介绍一下。
原代细胞培养需要注意细胞来源。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的细胞，因此需要注意细胞来源的选择。
一般来说，选择健康的、无感染的组织或器官作为细胞来源，可以获得高质量的原代细胞。
原代细胞培养需要注意细胞的处理。
在分离细胞时，需要使用无菌的工具和培养基，避免细胞受到污染。
同时，需要注意细胞的处理时间，过长或过短的处理时间都会影响细胞的生长和分化。
第三，原代细胞培养需要注意培养条件。
细胞的生长需要适宜的培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度、营养物质等。
因此，在进行原代细胞培养时，需要选择适宜的培养条件，以保证细胞的正常生长和分化。
第四，原代细胞培养需要注意细胞的传代。
细胞的传代次数过多会导致细胞的老化和突变，因此需要注意细胞的传代次数。
一般来说，原代细胞的传代次数不宜超过3-5次。
原代细胞培养需要注意细胞的检测。
在进行原代细胞培养时，需要对细胞进行定期检测，包括细胞形态、生长速度、细胞周期等方面。
如果发现细胞出现异常，需要及时停止培养并进行检测。
原代细胞培养是一项非常重要的实验技术，需要我们在实验过程中注意细胞来源、处理、培养条件、传代和检测等方面，以保证获得高质量的原代细胞。
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原代肿瘤细胞的分离培养实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞实验器材：新鲜人体乳腺癌组织胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×）手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱实验原理：酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。
胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。
本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。
实验步骤：1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。
2.将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3大小的碎块。
3.转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。
4.将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于３７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min于镜下观察一次。
5.待组织块镜下透光性良好，呈絮状时，转入15ml离心管中，1300r/min离心5min，弃上清。
6.加入PBS洗涤数次，反复吹打后，1300r/min离心5min，弃上清。
7.加入DMEM完全培养基（含1×双抗），反复吹打，转入培养皿中，镜下可见单个细胞及细胞团，细胞培养箱培养。
注意事项：1.全程严格无菌操作。
2.取材要注意新鲜和保鲜。
3.取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，尽可能减少对细胞的机械损伤，切碎组织时应避免组织干燥。
4.若组织在消化时间较长时仍未散开，可采用多次提取消化法以减少酶对已消化下来的细胞的损伤。
活细胞工作站分析技术一、本显微镜主要观察方法简介明场：适合常规镜检、病理、染色样品的观察方法。
此观察方法优点是视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单。
缺点是：透明标本对比度低，标本没有立体感。
相差：利用被检物体的光程（折射率x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。
鉴定活体细胞最实用、最经济的方法。
荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
荧光显微镜利用荧光光源激发样品中的荧光物质，检测激发光的情况以上各种观察方法配合活细胞孵育装置，即可完成对活细胞的各种观察要求。
活细胞孵育装置通过软件或TFT触摸屏中Incubation模块进行精细的调节。
二、系统开关机开机顺序1.打开显微镜电源总开关2.打开显微镜开关3.拍荧光时打开荧光光源4.打开电脑及软件关机顺序先关软件，然后是荧光光源、显微镜开关、电源开关！！三、明场观察成像操作流程1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑2. 打开卤素灯的光闸“TL” 使光线透过聚光镜穿透样品3. 调节光强，光路100%转到眼睛4. 聚光镜打到H 位5. 反射镜转轮打到BF明场位置6. 低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，然后再调至高倍7. 准备拍照了，首先光路切换至相机8. 打开软件，点开Live 按钮9. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——如果彩色模式拍照需要做自动或互动式白平衡（White balance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save10. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑四、相差观察成像操作流程1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑2. 打开卤素灯的光闸“TL” 使光线透过聚光镜穿透样品3. 调节光强，光路100%转到眼睛4. 聚光镜根据物镜后面的Ph标注打到Ph 1/ Ph 2 或Ph3位5. 反射镜转轮打到BF位6. 低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，进而转到高倍，根据个人不同需求7. 准备拍照了，首先光路切换至相机8. 打开软件，点开Live 按钮9. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——彩色模式下做白平衡——再次曝光后——Snap成像——保存Save10. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑五、荧光观察成像操作流程1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”)，荧光光源，孵育装置及电脑2. 先按明场或相差观察方法找到阳性信号3. 关闭卤素灯光闸”TL”，打开荧光灯光闸“RL”4. 反射镜转轮根据标记探针的颜色打到GFP，Rhod或DAPI5. 准备拍照了，首先光路切换至相机6. 打开软件，点开Live 按钮7. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——Snap成像——保存Save8. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑六、活细胞时序连拍流程时序模块可用于获取一定时间内的一系列图像，如活细胞长时间的观察和拍摄，生成的图像就是一个时间序列，可用于分析随时间变化的过程。
1.首先放好样品，调好曝光时间和焦距。
2.恒温孵育装置的各参数通过软件调节，在工作区找到Incubator可以对活细胞的环境条件：温度，CO2- 或O2的浓度进行精细调解。
3.在工作区激活Multidimensional Acquisition下的属性页。
4.在Experiment属性页选择Time lapse功能。
5.输入需要的时间间隔，例如2分钟。
时间单位可以从下拉菜单中选择。
6.然后输入想要获取的图像数目（# Cycles）。
从这两个数字可以计算出总的实验时间。
7.用户也可以输入时间间隔和总的持续时间，系统会自动计算图像数目。
选择需要计算的功能，也可以直接在输入区输入数值，然后单击键进行计算。
8.单击start开始取图。
取图进度通过一个进度条显示。
单击Cancel即可取消取图。
9.生成的图像显示在图像区，在这里可以用播放器对它进行操作。
该图象还未被保存，这时可以看见图象名字是*号。
最后保存或者导出图象即可完成一份时序连拍图。
肿瘤干细胞分选与鉴定技术原理肿瘤干细胞是肿瘤组织中少数具有无限增殖潜能的细胞，有很强的迁移、浸润、转移能力，能驱动肿瘤的形成和生长。
肿瘤干细胞纯化和培养是研究肿瘤干细胞各种生物学特性的基本手段。
目前肿瘤干细胞一般有以下几种分离方法：（1）悬浮成球法（2）磁珠分选法（3）流式分选法。
流式分选法以其高敏感性和高特异性被广泛的应用于肿瘤干细胞的分选。
本实验我们利用EpCAM标记肝癌干细胞并利用moflo XDP将其分离培养。
方法与步骤1、细胞准备将huh7细胞消化后离心，用PBS洗两遍离心并加100ulPBS悬浮；4℃抗体孵育30min；用PBS清洗两遍，离心后用PBS重悬等待上机。
仪器调试准备（1）开机，将液流调试好后，用Beads矫正好仪器;（2）清洗仪器，按照无菌水、酒精、无菌水的先后顺序各冲洗10min;（3）冲洗好仪器后，用仪器自带软件计算drop dealy ;（4）仪器准备好后，在软件上画好图。
3、分选（1）成球分选将96孔板加入200ul成球培养基，用流式分别将1个与10个EpCAM+/EpCAM- 细胞加入96孔板。
克隆形成分选将24孔板加入500ul成球培养基，用流式分别将50个与100个EpCAM+/EpCAM- 细胞加入24孔板。
增殖分选将96孔板加入200ul成球培养基，用流式分别将1000个EpCAM+/EpCAM-细胞加入96孔板。
其他实验分选将其剩余的细胞两路分选入接收管中。
注意事项消化细胞的过程中防止细胞消化过度。
如果消化过度会造成DNA外露造成细胞粘连成团，堵塞仪器。
上机分选前，细胞悬液中加入7AAD以排除死细胞。
死细胞可以从以下三个方面影响分选纯度①死细胞容易结合抗体，使肝癌干细胞的比例升高；②死细胞的抗原表位容易发生变化可以特异性的结合抗体；③死细胞的本底荧光高，影响抗体的表达量。
用表面maker标记肿瘤干细胞时，我们往往选择抗体表达量高的群体。
分选细胞中的双联体或多联体可以结合更多的荧光抗体，因此分选细胞时要将这部分细胞除去。
无菌操作。
Western操作步骤1、收集细胞，加入100μl裂解液和1μl蛋白酶抑制剂（比例100:1），置于冰上30min；2、4℃离心，15000rpm，15min；3、吸上清液于新EP管中（约60~80μl）；4、按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明测蛋白质浓度；5、加入电泳加样缓冲液（与吸取的上清比例为1:4），煮沸10min，缓慢恢复室温后，稍离心，可置于-20℃保存，实验时取出；6、制备凝胶：将洗净且干燥的两块玻璃板底端对齐后安放在灌胶支架上，参照分离胶配制体系依次加入各个组分，混匀。
将配置好的凝胶，沿玻璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡。
根据梳子深度确定灌制高度，通常距离矮板至少2cm，灌好后，注入酒精或水封胶。
此时可按照配方配制5%浓缩胶，注意TEMED在灌胶前再加入。
7、静置一段时间待凝胶聚合（约30min）。
凝胶聚合后，弃去封胶溶液，并用吸水纸吸干。
往浓缩胶里加入适量TEMED，混匀后缓慢灌入到胶槽至矮板顶部，插上梳子，操作时避免产生气泡。
静置一段时间（约30min）至凝胶聚合。
8、上样及电泳：安装电泳槽，注意确保内槽不漏缓冲液，往电泳槽加入足量电泳缓冲液，缓冲液要淹没过玻璃板和凝胶。
吸取适量样品和分子量标准Marker，缓慢加入至胶孔。
注意：加样太快会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时，要注意更换枪头，以免交叉污染。
上样完毕后，盖上电泳槽盖子，接通电源，设置电泳条件，恒压100-120V（可以先80V，待跑过浓缩胶后加至100V或以上）。