抗菌药物最小抑菌浓度的测定

抗菌药物最小抑菌浓度的测定

一、概念：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵育24 小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。

二、实验目的：通过采用常量稀释法，检测几种抗菌药物对■一菌株的最小抑菌浓度（MIC）, 对临床诊断用药有指导作用。

试剂: MH液体培养基无菌试管

分光光度计0.5麦氏标准比浊管

MH琼脂微量加样器

蒸儒水吸头

接种环

0.1 mol磷酸缓冲液

(PH6.0)

无菌生理盐水无菌平板

无菌滤膜0.22无菌针简

抗菌药物

金黄色葡萄球菌、大肠

埃希菌、铜绿假单胞菌

四、检验方法：液体稀释法、琼脂稀释法、E试验（E test）液体稀释法操作步骤：

抗菌药物原液

配置OOOOOOOOOOOOO

MH液体试管中抗菌药物梯度稀释

观察结果

1..抗菌药物原液制备

抗菌药物贮存液浓度不应低于1000ug/ml(如1280ug/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。

所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280ug/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750ixg/mgo用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg.根据公式计算所需稀释剂用量为：(182.6 mgX750ug/ml)/1280 ug/ml= 107.0ml,然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表1。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20C环境，并注意抗菌药物的保存期限。

表1稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法

2. 药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。

3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton (MH)肉汤，pH7.2~7.4o需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯哩西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%(W/V) 氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。

4. 接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个,接种于4-5ml的水解酪蛋白(MH)肉汤中,35P孵育2-61】。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含l~2X108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1 ： 100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接

种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。

5. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管(13X 100mm) 13支，排成一排，除第1管加入肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml,在第1管加入抗菌药物原液(如1280 ug/ml) 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25pg/mL然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml,使每管最终菌液浓度约为5X105CFu}ml°第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 ug/mL 另外设对照 3 支, 别为肉汤对照、质控菌对照和待测菌生长对照。

6. 孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35°C普通空气孵箱中孵育16~20h：嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡葡球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h°

7. 结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC.甲氧茉胺嚅陇或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC.

[MIC参考范围】

表2稀释法质控标准菌株MIC预期值范围(ug/ml)