土壤微生物测定指标的分析方法和适用范围

土壤微生物监测常规测定指标的分析方法和适用范围

其他方法：

一、土壤DNA提取和纯化：

方案1，参考(1, 2)

1.称取样品土样5g, 加入灭菌的石英砂，液氮研磨；

不要液氮研磨，这样子对DNA伤害很大，几乎全部片段化了。可以加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2－3min，使得土壤颗粒破碎。然后12000rpm离心5min，弃上清。

2.加入1

3.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇30min-2h

3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；

4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；可考虑再

增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。

5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；

6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀；

这个千万不要4度过夜啊，四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。

7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；

8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。

方案2：

购买DNA提取试剂盒，如SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 或UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO)

二、DNA定量和质量检测：

提取后的DNA使用紫外分光光度法进行浓度和纯度检测。DNA纯度以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值<1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA 。和定量，应用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小及完整度。

三、土壤宏基因组测序

将质检合格的土壤DNA随机打断，加接头序列构建测序文库，利用Roche 454或Illumina Hiseq系统进行测序反应。

四、生物信息分析：

1.原始数据整理、过滤及质量评估：

应用中科院青能所自主开发的质量控制软件QC-Chain进行原始测序数据的质量控制，去除低质量碱基和read，并进行污染序列的监控(3)。

2.宏基因组拼接和基因预测：

应用基于宏基因组数据聚类算法的拼接工具，进行宏基因组拼接和基因预测，如IDBA-UD(4)，MetaGeneMark(5)等。

3.群落可视化分析：

包括Parallel-META （2.0）、MetaSee、Meta-Storm以及Meta-Mesh等工具，具有群落样本分析，群落样本可视化分析，群落样本比较以及群落样本搜索和数据挖掘等功能。

4.基因功能分析：

基因功能注释

基因功能丰度差异分析

丰度差异的基因GO 富集分析

丰度差异的基因KEGG 富集分析

聚类分析（热图）

多元统计分析（根据实验设计）

基于物种丰度分析：

稀释曲线

Alpha多样性分析

物种丰度差异分析

聚类分析（热图）

多元统计分析（根据实验设计）

基于群落结构分析：

单样品物种分布

多样品物种分布

1. Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM. DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and environmental microbiology. 1996;62(2):316-2

2.

2. Jackson CR, Harper JP, Willoughby D, Roden EE, Churchill PF. A simple, efficient method for the separation of humic substances and DNA from environmental samples. Applied and environmental microbiology. 1997;63(12):4993-5.

3. Zhou Q, Su X, Wang A, Xu J, Ning K. QC-Chain: Fast and Holistic Quality Control Method for Next-Generation Sequencing Data. PloS one. 2013;8(4):e6023

4.

4. Peng Y, Leung HC, Yiu S-M, Chin FY. IDBA-UD: a de novo assembler for single-cell and metagenomic sequencing data with highly uneven depth. Bioinformatics. 2012;28(11):1420-8.

5. Zhu W, Lomsadze A, Borodovsky M. Ab initio gene identification in metagenomic sequences. Nucleic acids research. 2010;38(12):e132-e.