治疗性抗体

特点
①不仅保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，而 且使鼠源 性成分减少 70%左右
②其人源Fc 段能有效介导生物学效应功能，如抗体依赖性细 胞介导的细胞毒作用（Antibody dependent cell-medi－ ated cytotoxicity，ADCC）、补体依赖性细胞毒作用 （Complement dependent cytotoxicity，CDC）等 ③能自由地选择抗体的型、亚型、类、亚类、大小、结构域 及添加糖基化位点等，以利用其不同的生物学特点及理化 特性 ④由高效真核表达载体和人抗体恒定区组成的嵌合抗体表达 “盒子”可以容许插入不同的鼠单克隆抗体的可变区，缩 短操作和研制周期 ⑤操作相对简单 目录
3、人 -鼠嵌合抗体表达载体的构建
利用TP-PCR方法将鼠源 性基因和人的基因进行 拼接获得嵌合重链, 和 嵌合轻链，两者的PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳 分离,目的基因片断回 收后分别连接到载体上, 测序鉴定。
4、高效表达载体和宿主细胞的构建
用两种限制性内切酶分别酶切嵌合重链的 PCR 纯化产物及表达载体, 经琼脂糖凝胶电泳分 离、分别割胶回收后, 在 T4连接酶作用下连接， 连接产物转化感受态细菌, 抽提质粒后经PCR 和 酶切鉴定, 筛选出阳性克隆。进而用另外两种不 同的限制性内切酶酶切嵌合轻链的 PCR 产物以及 含有嵌合重链的质粒。按上述实验步骤构建并筛 选出含嵌合轻链的阳性克隆, 经基因测序验证, 获得共表达嵌合重、轻链的重组质粒。
◆多克隆抗体 治疗性抗体 ◆单克隆抗体
◆嵌合抗体
◆人源化抗体
多克隆抗体（polyclonal antibody）

多克隆抗体的概念 多克隆抗体产生原理 多克隆抗体制备方法流程 多克隆抗体特点
概念

在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体 内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不 同表位的单克隆抗体，其混合物为多克隆 抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质 上是由多种抗体组成的混合物，又称多克 隆抗体。
1、鼠抗体可变区基因的克隆
酶切法：杂交瘤细胞株 限制性内切酶
Southern印迹法
PCR技术：RT-PCR 扩增 逆转录 cDNA
模板 引物 琼脂糖凝胶电泳 RACE-PCR法：反转录 引物 扩增
2、人抗体恒定区基因的钓取
通常以 mRNA 为模板，RT-PCR 扩增抗体恒定区 CH1 ～ CH3 之间的序列。
治疗性抗体的概述
◆ 1890年Behring和北里柴三郎发现了可特 异中和外毒素的血清组合白喉抗毒素。 ◆ 20世纪70年代德国学者Konler和英国学者 Milstein研制了杂交瘤单克隆抗体（mAb）。 ◆ 抗体被认为是理想的癌症和传染病的治疗 分子。
治疗性抗体的概述
然而，鼠源mAb作为异源性蛋白在人体内
原理
这种技术保留了完整的鼠单抗可变区序列，
其亲和力和特异性都得到了保证，但也保留了鼠 可变区的异源性，仍可能诱导产生HAMA。
制备方法流程
主要步骤包括鼠抗体可变区基因的克
隆、人抗体恒定区基因的钓取、鼠抗体可
变区基因及人抗体恒定区基因的拼接以及
高效表达载体和宿主细胞的构建，筛选阳
性细胞和表达产物的鉴定。
特点
优点 ： • 在体外“永久”地存活并传代 • 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗 体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 • 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
缺点 ： • 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围
• • 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高
治疗性抗体——多克隆抗体， 单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗 体有何异同？（设计和制备原理， 临床使用的优缺点）现在上市各类 抗体有哪些？我国在这方面的差距
在哪？
治疗性抗体
——第四小组：王志雨 王玉凤 朱睿 田梦 史颖忻 张莉 李尚林 王胜
关键词：
治疗性抗体 多克隆抗体 单克隆抗体 嵌合抗体 人源化抗体 应用 差距 上市 情况
原理

二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。
机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特
异性的记忆B细胞迅速增殖分化为浆细胞，
产生特异性抗体。Th的记忆细胞也加快反 应的进行，在抗原作用1到2天后，抗体浓度 迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍 到几十倍。
制备流程

纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→
的应用受到了限制：
如：（1）可诱导鼠抗人抗体的生成 （2）鼠源性抗体Fc段不能有效地发挥人源 性Fc段的功能 （3)鼠源性抗体的生物半衰期很短。
抗体的治疗机制 （Cure mechanism of Ab）
（1）中和作用(Neutrilization) 用于感染性疾病，使病原体或其产生 的毒素丧失致病力。 （2）示踪或导向作用（Tracer or targeted effect） 使与其相连的功能性分子特异性地激 活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。
目录
单克隆抗体（monoclonal antibody; McAb; mAb ）
₤
单克隆抗体的概念
单克隆抗体产生原理 单克隆抗体制备方法流程 单克隆抗体特点
₤
₤
₤
概念
高度均质性的特异性抗体，由一个识别单 一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂 交瘤细胞。
原理

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具 有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能 力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生 免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分
谢谢
谢谢 谢谢
wenku.baidu.com
泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆
化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的 能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这 种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获 得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为
单克隆抗体技术。
制备方法流程

用抗原免疫小鼠，刺激机体诱生抗原 特异性B细胞。取该免疫小鼠脾细胞 （含有B细胞）与非分泌性小鼠骨髓瘤 细胞在PEG作用下进行细胞融合。由 于哺乳类细胞的DNA合成分为从头 （donovo)合成和补救（salvage）合成 两条途径，加入HAT选择培养基后， 未融合的骨髓瘤细胞死亡，未融合的B 细胞因不能在体外长期培养也发生死 亡，只有融合后形成的杂交瘤细胞可 在HAT选择培养基中存活和繁殖，其 既有骨髓瘤细胞大量扩张和永生的特 性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异 性抗体的能力。由于每个杂交瘤细胞 由一个B细胞融合而成，而每个B细胞 克隆仅识别一种抗原表位，故经筛选 和克隆后的杂交瘤细胞仅能合成及分 泌一种均一的抗体，即为单克隆抗体
人源化抗体（humanized antibody ）

人源化抗体的概念
人源化抗体产生原理


人源化抗体制备方法流程
人源化抗体特点
概念
★将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到
人抗体可变区框架中而制成的抗体。此抗 体可明显降低由鼠源单克隆抗体所致的人
抗鼠抗体反应。
原理及制备过程
★人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体 和全人源化抗体等几类 ★嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、
★2.规模小
从规模上来看，我国在研究生产抗体药物上 与国外发达国家相比规模小，技术落后，研发规 模也不大，而且药企对抗体药物这部分的投入不 是很大，在人才方面，我国专门做抗体药物研究 的人才也寥寥无几，这都对我国的抗体药物研发 带来不利的影响。
★参考文献： 《医学免疫学》第五版 《医学生物制品学》第二版
★表面重塑抗体
是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。
★表面重塑抗体
是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。
★全人源化抗体
是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技 术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程 改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗 体，达到抗体全人源化的目的。
特点
★具有较长的半衰期，低免疫原性，
目录
嵌合抗体（chimeric antibody ）

嵌合抗体的概念
嵌合抗体产生原理


嵌合抗体制备方法流程
嵌合抗体特点
概念


广义上讲：嵌合抗体指不同物种来源的免 疫球蛋白的V基因和C基因重组后所编码的 抗体。 狭义上讲：由于目前嵌合抗体的研究以人 鼠嵌合抗体为主，故嵌合抗体又指利用 DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区 基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中， 转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合的抗体。
（5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及 广泛性。
治疗性抗体的应用
（1）抗肿瘤作用(Anti-tumor)
（2）抗感染作用(Anti-infection)
（3）抗器官移植排斥反应(Anti-repelling （4） 抗血栓形成(Anti-formation of thrombus ) （5）解毒(Detoxicating) （6）构建抗独特型抗体疫苗(Constuction of antiidiotype vaccine) （7）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用（apply to immunity disease and abnormality reaction）
注射动物体内（剂量，次数，途径等均要 适宜）→测定效价（如效价高，则不必加
强免疫）→1周后经动脉放血→分离血清→
纯化抗血清备用
特点

优点：作用全面，具有中和抗原、免疫调
理、介导补体依赖的细胞毒作用（CDC）、
ADCC等重要作用，来源广泛，制备容易。

缺点：特异性不高易发生交叉反应，也不 易大量制备，从而应用受限。
原理

首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等 中提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别 扩增出抗体的重链及轻链基因，利用DNA重组技
术将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的细
胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细 胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分 子，筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手 段纯化抗体片段。
原理

初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低。

机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在巨噬细 胞和Th细胞的作用下，B细胞被激活，增殖分化为浆细胞 和记忆B细胞。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时， 只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导 而增生分 化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T细胞的激活和循环 抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体浓度 很快下降。
还能与天然效应因子相互作用，因此将更 广泛的被应用于一系列免疫、感染和病毒 性等疾病。
★需要多次重复使用，并且应用剂量
较大。人源化抗体往往达不到原来鼠单抗 的结合能力。
全球治疗性抗体上市情况列表
差距
★1.原创性不足
我国抗体药物的原创性不足，具有自主知识
产权的抗体药物很少，很多抗体药物都只是在实
验室的研究阶段，距离产业化还有相当大的距离， 另外，动物细胞规模化培养技术与国外相比差距 也很大
抗体的治疗机制
（3）竞争性抑制作用/拮抗作用(Competitive inhibition) 与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分 子作用产生毒性损害。
（4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（Ab dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC） 及补体依赖性细胞溶解作用（Complementarity dependent cytolysis, CDC）。
重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载 体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样 表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区 是人源的，这样整个抗体分子的近2／3部分都是 人源的。
★改型抗体
也称CDR植入抗体(CDRgraftingantibody)，抗体 可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接 决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源 抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得 鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性