医学分子生物学实验技术精品PPT课件

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材料的选择与处理 材料的选择
有效成分：欲纯化的某种单一的生命大分子 物质。相对于有效成分以外的物质称杂质。
组织、器官
动物
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
材
血液、分泌物
料 植物 根、茎、叶 来
源
微生物
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选材原则： ①含有效成分丰富、稳定性好； ②来源丰富、保持新鲜； ③材料适合加工提取； ④具有经济利用价值。
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比色法
葡萄糖＋O2 ＋H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸＋H2O2
H2O2＋酚＋4－AAP
醌亚胺＋H2O
浊度法：测定悬浮液在不被吸收的波长下表
观的消光值。 电化学法：测定反应过程中H＋的浓度变化从 而计算出有效成分含量。
生物活性检测
免疫分析法
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纯化方案的设计与评价
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蛋白质纯化的总目标是增加制品的 纯度(purity)或比活(specific activity)， 以增加单位蛋白质重量中所要蛋白 质的含量或生物活性(比活常以活力 单位数／毫克蛋白质表示)。 分离纯化某一特定蛋白质的一般程 序可以分为前处理、粗分级分离和 细分级分离3步
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纯化方案的设计与评价
纯化方案的评价：是对组成纯化方案的 每一种分离方法的评价。
有效成分的含量测定
评 价 指 标
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比活力测定(
活力单位数 毫克蛋白
)
纯化倍数(
每步的比活力 粗提液比活力
)
收得率(
每粗步提的液总总活活力力×100％
)
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蛋白质纯度和性质的分析
纯度分析
比活性 电泳分析
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(1) 前处理 (pretreatment)
• 分离纯化某一蛋白质，首先要求把 蛋白质从原来的组织或细胞中以溶 解的状态释放出来，并保持原来的 天然状态，不丢失生物活性。
• 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪 组织。
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种子材料应先去壳甚至去种皮以免 受杂质的污染，油料种子最好先用 低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择适当的 方法，将组织和细胞破碎。
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(2) 粗分级分离 (rough fractionation)
• 当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获 得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与 其他杂蛋白分离开来。
• 一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有 机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、 处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐)，又能 浓缩蛋白质溶液。
• 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的， 结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态， 此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶 过程。
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第二节 确立测定方法
寻找哪些生物材料中含有有效成分
监测有效成分提纯程度 吸收光谱
光谱法 荧光光谱
浊度分析
电化学法 生物活性检测法 免疫分析法
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免疫分析 高压液相或气相色谱
性质分析
分子质量测定 分子结构测定
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几种常用的蛋白质纯化方法：
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第一章 蛋白质的分离纯化
• 生命大分子物质的特点： • 1、生命大分子是动物、植物和微生物在进
行新陈代谢时所产生的活性物质
• 2、生命大分子的特殊性和复杂性 • 3、生命大分子都是由简单的小分子构成的
物
• 4、具有特殊的结构和功能 • 5、生命大分子不稳定
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吸收光谱
根据有效成分的颜色、对紫外吸收能力进行 测定； 利用有效成分与生色基团所进行的特殊的呈 色反应进行测定。 荧光法：利用有效成分所进行的特殊的化学 反应并偶联NAD＋或NADP＋的还原反应产生 NADH或NADPH。还原型尼克酰胺发荧光。 也可利用NAD和NADP的光谱变化进行测定
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• 有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或 盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻 真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓 缩。
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(3) 细分级分离 (fine fractionation)
进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶 过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲 和层析等。必要时还可选择电泳法，包 括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯 化步骤。用于细分级分离的方法一般规 模较小，但分辨率很高。
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(4) 结晶
• 结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋 白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽 管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但 只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才 能形成结晶。
• 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋 白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断 定制品处于天然状态的有力指标。
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机械破碎法 物理破碎法
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声破碎法
化学破碎法 利用化学渗透的方法，通过有机 溶剂、抗生素、表面活性剂、金属熬合剂、变 性剂等，使细胞膜破碎的方法。
酶促破碎法 利用酶的活性破坏细胞膜的化学 结构使细胞膜破碎的方法。
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研究对象的选择
组织差异性
时间差异性
生理状态差异性
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• 蛋白质在组织或细胞中一般都是以 复杂的混合形式存在，每种类型的 细胞都含有上千种不同的蛋白质。 蛋白质的分离(separation，isolation) 和纯化(purification)工作是生物化学 中一项艰巨而繁重的任务。
纯化方案：在纯化某一物质过程中，根 据被分离物质的理化性质、分离方法的 优劣，将几种分离方法有机地结合并灵 活应用，实现提取被分离物质的技术路 线，称纯化方案。
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纯化方案的设计与评价
初分离 精细分离
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盐析法 有机溶剂沉淀法
电泳法 离子交换层析 层析法 排阻层析 离心法 亲和层析
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• 如果所要的蛋白质主要集中在某一 细胞组分，如细胞核、染色体、核 糖体或可溶性的细胞质等，则可利 用差速离心方法将它们分开
在不同离心力场下沉降的细胞器
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如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜 质细胞器结合的，则必须利用超声波 或去污剂使膜结构解聚，然后用适当 的介质提取。
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