实验七 细菌转化

实验所用的质粒是pUC19，全长2686个碱基 对（bp），在质粒的 10-110 bp段为多克隆
位点区域，含有 Pst I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、 BamH I、Sac I等多种限制性内
切酶的位点。
实验原理 关于外源DNA片段的获得
特异性DNA片段的PCR扩增 1. PCR扩增出的基因组片段 2. cDNA
实验原理
关于载体——质粒
质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中， 独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性：
1．含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片段。 2．对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。 3．选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌， 便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂 平板上传代。 4．在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一 细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此，质粒已成为分子生物学中使 用最为广泛的载体。
质粒的连接、转化与鉴定
孔忠新 2015.11.24
实验目的
1. 学习掌握质粒连接和转化的原理和一般技术 2. 学习和掌握重组质粒的检测原理与方法
为什么需要质粒转化
1. 放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测等。 2. 携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达。 3. PCR产物的克隆和测序。 4. 构建基因库、cDNA库等。 5. 纯化基因片段
化学方法人工合成的DNA片段
实验原理
关于外源DNA片段与载体 的连接重组
采用由Hind III切割开的pUC19 质粒，以及由Hind III切割PCR
片 段 ， 用 T4 噬 菌 体 DNA 连 接 酶 将 PCR 片 段 与 切 割 开 质 粒 DNA 片 段 重 新 连 接 成 一 个 环 状 的 DNA 分 子 ， 即 把 目 的 基 因 DNA 插 入 质 粒 DNA ， 实 现 质粒重组。
在外源基因插入后LacZ基因
的阅读框架被破坏，细菌内 无半乳糖苷酶活性存在，菌 落呈白色（阳性克隆）。
材料
E. coli DH5α（或JM105）菌株（感受态），
转化用的质粒， 无菌1.5mL的eppendorf管
仪器
恒温摇床， 台式高速离心机， 恒温水浴锅， 电热Βιβλιοθήκη Baidu温培养箱， 超净工作台， 微量移液枪
➢ 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程 称转化。
➢ 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。
➢ 根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 ➢ 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使
质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。 常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19 ➢ 表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核 细胞内，使目的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。 常用的表达载体： 原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin
实验原理
关于重组质粒的筛选与鉴定
实验原理
关于重组质粒的筛选与鉴定
半乳糖苷酶的蓝白斑筛
选系统在质粒中含有LacZ基
因 的 a- 肽 序 列 ， 当 无 外 源 DNA 片 段插入 时 ， 质 粒 表
达 a 肽 ， 它 与 宿 主 菌 的 Lac ZM15 基 因 的 产 物 互 补 ， 产
生有活性的B-半乳糖苷酶， 在含有指示剂X-gal和诱导剂 IPTG 存 在 的 情 况 下 ， 菌 落 呈蓝色（质粒自身环化）；
试剂
LB固体和液体培养基， 氨卞青霉素
操作步骤
1. 从-70℃冰箱中取100μl（或50 μL）感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解 冻后立即置冰上。
2. 加入2 μl质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3. 42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分 钟。
插入外源DNA
外源DNA和质粒都是用同样的两个酶切的，然后构建成含有外 源基因的质粒
目标DNA
质粒载体
实验原理
关于感受态细胞(Competent Cells)
野生型E.coli并不容易转化，这是由于生物自身的免疫机制决
定的。细菌可以产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。经过多 年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA 的效率。那就是通过化学等特殊方法处理细胞，使其改变膜对 DNA的 通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入 核酸分子时的生理状态。
➢ 限制性内切酶（restriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的 一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的 一种蛋白酶。
➢ 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。
➢ 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团 的末端 。
重组质粒
重组质粒 短暂热刺激或电击
野生型E.coli
CaCl2 低温
感受态细胞
实验原理
关于质粒转化技术
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形， 转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于 细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合 物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。 在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板 上可挑选所需的转化子。
电 击 法：使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细 胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核 酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。做电击转化时，悬液 中有近70%的细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效 率 很 高。当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用 电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。