生物化学实验六 蛋白质的酸水解及其氨基酸的纸层析鉴定

实验六蛋白质的酸水解及其氨基酸的纸层析鉴定

一、目的要求

学习和掌握蛋白质的水解方法以及纸层析法分离氨基酸的基本原理和方法。

二、实验原理

蛋白质可用酸、碱或酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、铵肽酶、羧肽酶、二肽酶等)水解，其最终产物为氨基酸。碱法水解产生的氨基酸要发生外消旋化，产生等物质的量的D-和L-氨基酸的混合物；酶法水解需要多种酶的联合作用，才能将蛋白质完全水解为L-氨基酸。最常见的是酸法水解，其优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L-氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸法水解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物呈棕黑色，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。展层剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置由迁移率(Rf)来表示：

点样点到层析点中心的距离

Rf= 点样点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下，某种物质的Rf是常数。Rf的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量与层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法来分离蛋白质酸水解液中的氨基酸。

三、材料、器材与试剂

1〉材料

酵母粉。

2〉器材

安瓿瓶、干燥箱、蒸发皿、沸水浴、试管、烧杯、铅笔、尺子、层析缸、层析滤纸、、毛细管、喷雾剂。

3〉试剂

(1) 6mol/L盐酸。

(2) 10%的异丙醇。

(3)展层剂(4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物)：将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层即可。

(4)标准氨基酸溶液：分别配制0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组分浓度均为0.5%)各5ml。

(5)显色剂：0.1%水合茚三酮-正丁醇溶液。

四、实验步骤

(1)蛋白质的酸水解：称取大约0.2g酵母粉，装入一个安瓿瓶中。向瓶中加入1ml 6mol/L 的盐酸，于火焰上封口。再将安瓿瓶放干燥箱内，在110~120°C下水解24h。然后把安瓿瓶内的水解液倒进蒸发皿内，放入沸水浴上加热以出去盐酸。再向蒸发皿内加入少量蒸馏水溶解残留物，继续在沸水浴上加热除去水分。当水解液的pH接近3时，将水解液再次蒸干后，溶解于0.5~1.0ml 10%的异丙醇中备用。

(2)取层析滤纸(22c m×14cm)一张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每隔1.6cm作一点样点。在点样点下用铅笔标明试样简称。

(3)点样：用毛细管将各标准氨基酸样、混合标样及待测样品分别点在其相应的点样点上。每个样点点两次。控制使其扩散斑的直径不超过0.5cm。

(4)展层：将滤纸卷成圆筒状，用胶带粘合(点样的一端在下并向外)。将约20ml扩展剂

置于密闭的层析缸中，并将圆筒状滤纸直立于其中(点样的一端在下并向外，展层剂的液面需低于点样线1cm)，盖好盖子。待溶剂前沿上升到距滤纸顶端1cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

(5)显色：用喷雾器往滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮-正丁醇溶液，用热风吹干即可显示出各层析斑点。

五、结果处理

(1)计算标准氨基酸和水解液中分离出来的各种氨基酸的Rf。

(2)比较Rf，确定酸水解样中有哪些氨基酸。

实验结果：

(1)Rf(赖氨酸)=1.7/9.5=0.179 Rf(脯氨酸)=3.3/9.55=0.346

Rf(缬氨酸)=5.0/9.5=0.526 Rf(苯丙氨酸)=5.8/9.5=0.611

Rf(亮氨酸)=6.3/9.5=0.663

(2)酸水解液中的氨基酸有：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。