反转录酶AMV使用说明(Promega)

反转录酶AMV使用说明（Promega）

1、产品简介

Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase(AMV RT，AMV逆转录酶)催化以DNA、RNA或RNA-DNA杂交体为模板的DNA聚合反应。它需要引物(DNA引物比RNA引物效率更高)以及Mg2+或Mn2+。该酶具有固有的RNase H活性，非离子表面活性剂和氢硫根化合物可在体外增加该酶的活性。

2、特点

温度稳定性：由于AMV RT在较高反应温度下较稳定(37-58℃)，特别适用于具有复杂二级结构的模板的逆转录。

3、应用

1）cDNA第一链和第二链的合成

2）引物延伸和RNA测序

3）RT-PCR（使用Taq DNA聚合酶时，50μl PCR扩增体系加10μl包含AMV RT和提供的AMV RT缓冲液的RT反应液。如果使用的是GoTaq®DNA聚合酶或者PCR Master Mix，50l PCR扩增体系加25l的RT反应液）。

4、使用方法

1）以使用2g的RNA为例。首先准备无核酸酶的离心管，将模板RN A 加入到管内，然后加入引物，引物加入比为0.5g/g RNA，总体积不得大于11l。最好不要改变引物模板比。70℃加热5min，冰浴5min，短暂离心收集至管底。

2）将下列成分加入到上述退火后的引物-模板混合物中。

AMV RT5×Reaction Buffer5l

dNTP mix 2.5l

RNasin Ribonuclease Inhibitor25units

Sodium pyrophosphate，40mm（预热到42℃） 2.5l

AMV RT200units

无核酸水至最后体积25l

3）轻弹混匀，从中取出5l加入到另一含有2-5[-32P]dCTP的试管中。剩余的20l先不要标记。注意：[-32P]dCTP配制时间不超过一周。

4）若使用的是Oligo（dT）引物则在42℃孵育60分钟，若使用的是随机六聚体引物则在37℃孵育60分钟。

5）将两管溶液分为标记的和未标记两种，放在冰上，添加95l的50mM EDTA溶液到标记管中（示踪者），总体积为100l，示踪管可用于核素掺入实验以及凝胶分析实验。

6）利用未标记管中的第一链产物进行第二链的合成反应（参照文献4、5）。

5、随酶提供的物品

dNTP mix10mM

5×Reaction Buffer

6、参考文献

1.Kacian, D.L.(1977)Methods for assaying reverse transcriptase. Meth.Virol.6,143.

2.Krug,M.S.and Berger,S.L.(1987)First-strand cDNA synthesis primed with Oligo(dT).Meth.Enzymol.152,316-25.

3.Mierendorf,R.C.and Pfeffer, D.(1987)Sequencing of RNA transcripts synthesized

in vitro from plasmids containing bacteriophage promoters.Meth. Enzymol.152,563–6.

4.Universal RiboClone®cDNA Synthesis System Technical Manual #TM038,Promega

Corporation.

5.Sambrook,J.Fritsch, E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory

Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,8.64.