柱后衍生化高效液相色谱法测定妥布霉素滴眼液的含量

柱后衍生化高效液相色谱法测定妥布霉素滴眼液的含量

何丹;杨林

【摘要】目的建立高效液相色谱-柱后衍生法测定硫酸妥布霉素含量的方法.方法色谱柱为Waters SunFire C18(4.6mm×150mm,5μm);流动相为含戊烷磺酸钠和冰醋酸的硫酸钠溶液;柱温30℃,流速1.2mL/min.柱后衍生化试液为邻苯二甲醛溶液,流速0.5mL/min,衍生化反应温度60℃,荧光激发波长360nm,发射波长440nm.结果硫酸妥布霉素在4.15～62.28mg/L浓度范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率(n=9)为99.5%.结论该方法简便快速,结果准确可靠,重复性好,可用于硫酸妥布霉素的定量分析.

【期刊名称】《中国抗生素杂志》

【年(卷),期】2010(035)010

【总页数】3页(P771-773)

【关键词】妥布霉素;高效液相色谱法;柱后衍生;荧光检测

【作者】何丹;杨林

【作者单位】重庆医科大学药学院,重庆市药物工程研究中心,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆,400016;重庆市药品检验所,重庆,400015

【正文语种】中文

【中图分类】R978.1

硫酸妥布霉素(tobramycin sulfate)为氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰阳性菌和阴

性菌均具有良好的抗菌作用。因其无紫外吸收，美国药典31版采用柱前衍生化高效液相色谱法测定含量，但操作繁琐，影响因素多，不易控制，衍生化试剂易污染色谱柱。英国药典2008版采用HPLC联用电化学检测器进行分析。中国药典2005年版则采用微生物检定法进行含量测定[1]，但微生物效价测定法不能排除产品中理化性质与妥布霉素相近的其他氨基糖苷类杂质的干扰。妥布霉素中可能存在新霉胺和卡那霉素B两种结构相似的杂质[2]，其中妥布霉素与卡那霉素B的唯一不同之处在于其3'位脱氧[3]，见图1。本文建立的高效液相色谱-柱后衍生法是一种简便、快捷的分析方法，较柱前衍生具有更好的稳定性生且妥布霉素与卡那霉素

B、新霉胺能得到良好分离。

1 仪器与试剂

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪(包括柱后衍生装置)；Waters 2475荧光检测器；Mili-Q Academic超纯水系统。

图1 妥布霉素及其主要杂质的结构Fig.1 Structures of tobramycin and chief impurities

妥布霉素滴眼液(批号：09E08J；09F24J；09D07J美国爱尔康眼药厂)，妥布霉素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130527-200402)；卡那霉素B对照品(中国药品生物制品检定所，批号：30548-200501)；新霉胺对照品(中国药品生物制品检定所，批号：30411-200307)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters SunFire C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为含戊烷磺酸钠和冰醋酸的硫酸钠溶液[4](取无水硫酸钠28.4g，加水1000mL溶解后，加戊烷磺酸钠2.6g和冰醋酸1.0mL，振摇使溶解)；柱温30℃；流速1.2mL/min。衍生化试液[5-6]：取硼酸9.3g和氢氧化钠4.7g，加水1000mL溶解后，用氢氧化钠

或硼酸调节pH值至10.0，加聚氧乙烯月桂醚1.0g、2-巯基乙醇2mL和邻苯二

甲醛乙醇溶液(0.810)10mL，振摇使溶解；流速0.5mL/min；衍生化反应温度为60℃；荧光检测器激发波长360nm，发射波长为440nm；进样体积10μL。

2.2 系统适用性试验

分别取妥布霉素、卡那霉素B与新霉胺对照品适量，加水溶解并稀释成每1mL含妥布霉素、卡那霉素B 20μg与新霉胺10μg的溶液，按上述色谱条件进样10μL，记录色谱图，见图2。结果表明，妥布霉素、卡那霉素B、新霉胺峰能完全分离(各峰之间分离度均大于2.0)。

2.3 专属性试验

量取处方量空白辅料1mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样10μL，

记录色谱图，见图2。结果表明专属性良好，空白辅料和杂质对妥布霉素的测定无干扰。

2.3 线性关系考察

精密称取妥布霉素对照品0.02076g，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液1、2.5、5、7.5、10、15mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为4.15～62.28mg/L的系列对照品溶液。按上述色谱条件测定，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归

方程为：

A=1.541×106C-5.769×106，r=0.9999

以信噪比S/N=10计，定量限为0.34ng(以进样10μL计)。结果显示妥布霉素浓

度在4.15～62.28mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

图2 混合对照品溶液(a)及空白辅料溶液(b)色谱图Fig.2 Chromatogram of stand

mixture (a) and solution of blank (b)

取线性试验中浓度为20.76mg/L的对照品溶液，连续进样6次，测定妥布霉素的峰面积，RSD为0.34%(n=6)。

2.5 稳定性试验

取线性试验中浓度为20.76mg/L的对照品溶液，室温下放置0、1、2、4、6、8h，分别进样测定妥布霉素峰面积，RSD=0.46%(n=6)，表明溶液在8h内基本稳定。

2.6 重复性试验

精密量取同一批号的妥布霉素滴眼液6份，加水稀释成每1mL约含20μg的溶液，测定其含量，结果平均含量为99.8%，RSD为1.03%(n=6)。

2.7 加样回收率试验

精密量取已知含量的妥布霉素滴眼液，精密加入标示量80%，100%，120%的妥布霉素对照品各3份，按上述色谱条件依法测定，平均回收率为99.5%(n=9)。2.8 样品含量测定

精密量取妥布霉素滴眼液1mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取妥布霉素对照品，精密称定，加水溶解并稀释成每1mL约含20μg的溶液，作为对

照品溶液。分别进样10μL分析，按外标法以峰面积计算，并与中国药典抗生素微生物检定法测定结果比较，见表1。

表1 妥布霉素滴眼液含量测定结果(n=3)Tab.1 The results of assay for tobramycin sulfate injection批号柱后衍生法微生物检定法09E08J 101.2% 102.9%09F24J 99.8% 102.4%09D07J 92.3% 96.8%

3 讨论

氨基糖苷类抗生素极性很强，在反相色谱条件下无保留，在流动相中加入离子对试剂戊烷磺酸钠与无水硫酸钠，被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化