血管增生疾病

※作用于血管内皮细胞的内源性抑制因子是研发焦点：
◇作用于血管内皮细胞，副作用小，不会产生抗药性
◇仅作用于增殖的血管内皮细胞，抑制新生血管，对 已有正常血管无影响 ◇研究最早的两个内源性血管增生抑制因子： Angiostatin、Endostatin成功用于肿瘤生长抑制 的实验研究，FDA于1999年批准进行治疗实体瘤I期 临床试验（EntraMed 公亡 ☆体外实验,人血管内皮细胞培养液中凋亡阳性细胞 数随PEDF剂量的增加而增加 ☆体内实验, PEDF处理的高氧动物的视网膜凋亡内皮 细胞与未处理相比高8倍，对已存在的正常血管内 皮细胞无反应，说明PEDF仅对活化的血管内皮细胞 起作用
☆PEDF与胶原蛋白－І和肝素有高度亲和性，提示 PEDF 可能作用于细胞粘附分子，即靶向细胞外基质来调 节其抑制血管内皮细胞增生的活性
新生血管性眼病 ☆ 眼表新生血管性病变 全球1000万，中国100万 ☆ 糖尿病性视网膜病变 美国有糖尿病患者近两千万人，糖尿病史超过十
年者约50%并发视网膜病
☆新生血管性眼病已成为西方国家致盲的首位因素
☆ 糖尿病性视网膜病变
☆角膜新生血管
正常角膜无血管，病理状态下，毛细血管会从角膜 缘血管网侵入角膜，引起角膜新生血管 原因：佩戴角膜接触镜、眼外伤和既往手术史、感 染性和免疫性眼病、碱烧伤等 新生血管对感染的消除、创伤的愈合、抑制免疫反 应介导的角膜溶解等有一定作用，但结构脆弱，易 渗透，常由于出血渗出及继发的纤维化等导致失明
3.低氧对VEGF表达的影响及低氧诱导因子1（HIF-1） 的调控作用 ☆低氧主要通过活化VEGF基因的转录和增加VEGF mRNA稳定性，上调VEGF基因表达从而促进血管新生 ☆低氧或缺血条件下，HIF-1能增加一些基因如红细 胞生成素(EPO)和VEGF基因的转录，增加氧输送能 力；葡萄糖转运体和糖酵解酶基因的转录；胰岛素 生长因子基因的转录，促进细胞的生存 ☆HIF-1是由α和β亚单位组成的异源二聚体，其中 HIF-1α是专一调节O2的HIF-1亚单位，决定了HIF-1 的活性
☆VEGF165具有肝素结合活性，约50%以可溶性形式分 泌至细胞外，其余的部分和细胞膜或基底膜上含有 肝素或硫酸乙酰肝素的蛋白多糖紧密结合 ☆ VEGF165这种可溶与不溶的形式似乎更符合机体对 血管形式应答调节机制，当机体需要时，即以较 大限度的可溶性形式存在；一旦血管形成应答 过度，又以不溶形式结合到基膜上，减少其危害； ☆ VEGF165体内表达丰度最高，也是体外研究中主要 的生物学活性形式
☆虹膜新生血管
虹膜新生血管并非虹膜的原发病，它通常继发于许 多眼其他部位的疾病和全身性疾病 主要的病因有视网膜中央静脉阻塞和糖尿病 导致失明和眼球摘除的常见原因
在美国，每年约有12%-15%的眼球摘除病例是由于 虹膜新生血管引起的失明和疼痛所致
第二节 血管增生的分子机制 一、新生血管形成的平衡假说
※ 现有内源性抑制因子存在问题：
◇分子量大，性质不稳定；原核表达体系多为无活性、 不溶性蛋白沉淀 ◇基因治疗较直接应用活性多肽的途径效果差
◇分子机制不明确：结构和功能的关系尚需深入研究； 特异性受体尚未分离出来 ；胞内信号转导通路不清
二、血管新生刺激因子
☆血管新生刺激因子包括表皮生长因子（EGF），碱 性成纤维生长因子（bFGF），转化生长因子 （TGF），血小板源生长因子（PDGF），胰岛素样生 长因子（IGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等 ☆ VEGF作为最强的内皮细胞特异性刺激因子，在多种 血管增生性眼病中起核心作用 ☆以VEGF作为刺激因子的代表，介绍其在血管生成中 的作用和分子机制
血管增生性疾病的分子基础
高国全
Tel：87331575
第一节 血管增生和血管增生性疾病
一、血管增生的概念 ：
☆从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程
☆在创伤和外周循环闭塞情况下具有恢复血供和促进
伤口愈合的积极作用
☆肿瘤和血管增生性眼病等疾病的主要病理特征之一
☆ 以血管增生为靶点正成为治疗恶性肿瘤和其他血 管增生性疾病的研究热点
2.VEGF受体结构特征 ☆VEGF受体主要有两种：VEGF受体1（fms-like tyrosine kinase, Flt-1）和VEGF受体2（fetal liver kinase 1/kinase insert domaincontaining receptor，Flk-1/KDR）
☆表达基本局限于血管内皮细胞上，都为穿膜蛋白， 含有7个细胞外免疫球蛋白样功能区，一个跨膜区 和一个细胞内酪氨酸激酶功能区
☆与其他血管因子的相互作用：PEDF下调VEGF表达； K5上调PEDF、下调VEGF表达
☆机制尚有许多疑问：是否存在PEDF特异性受体； PEDF抑制内皮细胞的信号转导通路等
3. PEDF与肿瘤的关系
☆PEDF抗肿瘤活性：诱导肿瘤细胞分化；抑制血管生 成；促进Schwann 细胞及神经节细胞产生更多的 PEDF，可能是神经母细胞瘤自然好转的缘故
☆肿瘤细胞分泌的VEGF以旁分泌的形式作用于血管内 皮上的特异受体,诱导血管新生促进肿瘤的生长和 转移 ☆VEGF可能通过自分泌促进肿瘤细胞自身的生长：某 些肿瘤细胞自身确有一定量的VEGF表达；在Kaposi 肉瘤细胞中检测到高水平的flt-1和KDR；抑制VEGF 的表达能显著抑制瘤细胞的生长
☆ 血管生成是一个复杂的过程，包括选择性降解血 管基膜和周围的细胞外基质、内皮细胞增殖和迁 移、最后形成毛细血管芽。
二、血管增生性疾病
肿瘤
血管增生与肿瘤生长 ☆实体性肿瘤的生长依赖于血管增生
☆新生血管长入前呈线性增长（血管前期或浸润前期）
☆新生血管长入肿瘤即呈指数生长（肿瘤血管期）
☆新生血管长入不仅提供肿瘤生长需要的营养物质和 氧气以及带走代谢废物，还为肿瘤细胞提供生长因 子如FGF-1和FGF-2等
三、血管新生抑制因子
内源性血管生成抑制因子： ☆蛋白质家族中的一些成员 丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（serine proteinase inhibitor，serpin super family）中的PEDF， KBP，antithrombin，maspin等，以PEDF为例介绍 该类抑制剂的特点 ☆蛋白质大分子前体的水解产物 angiostatin，K5，endostatin，tumstatin等 以K5为例
☆前列腺癌组织中PEDF含量显著下降或缺如
☆在黑色素瘤细胞系中首次检测到PEDF基因的缺失 ☆ PEDF基因和p53基因均位于染色体17p13.1, 肿瘤 发生与该区域关系密切,提示PEDF基因可能是抑癌 基因或是肿瘤相关基因
4. PEDF治疗血管增生性眼病
☆Stellmach等腹腔内注射重组PEDF显著抑制了早产 性视网膜病（ROP）小鼠模型的视网膜血管增生 ☆Mori等在三种不同的眼血管增生模型中眼内输送 AdPEDF取得显著疗效：激光诱导的色素膜损伤所致 脉络膜新生血管(CNV)鼠模型；rhodopsin/VEGF转 基因鼠；ROP小鼠模型 ☆AdPEDF眼内输送不仅抑制视网膜和脉络膜新生血 管形成，还可逆转已形成的新生血管 ☆FDA批准PEDF基因治疗进入Ⅰ期临床试验（2003年）
☆机械性阻断或应用血管增生抑制剂剥夺肿瘤的血供 显著抑制甚至完全阻止肿瘤的生长
血管增生与肿瘤转移
☆血管生成不仅是肿瘤生长所必需，而且还是肿瘤细 胞发生转移所需要 ☆新生毛细血管的内皮细胞能分泌胶原酶和组织纤溶 酶原激活物，促进基质降解，便于肿瘤细胞脱落进 入血管和向邻近基质扩散
☆血管前期，循环中极少有肿瘤细胞，但在肿瘤血管 化后，肿瘤细胞才持续出现在循环中
1.PEDF的抑制血管增生活性
☆Dawson于1999年首次发现PEDF具有很强的抑制血管 增生的作用, 是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血 管形成的主要原因
☆是血管生成最有效的天然抑制剂，比血管抑素、内 皮抑素活性更高
☆Gao等在视网膜新生血管大鼠模型中检测到视网膜 组织VEGF的含量较正常对照组升高5倍，PEDF的 含量下降了2倍，显示出在视网膜病理新生血管形 成中，血管抑制剂与血管刺激剂之间的平衡被打破
※根据这一理论，抑制新生血管的策略有： ◇拮抗血管生成刺激因子 ◇应用血管生成抑制因子
以纠正病理性平衡失调
※拮抗血管生成刺激因子
◇拮抗血管增生刺激因子主要围绕对VEGF的阻断
◇中和VEGF的单克隆抗体已进入临床II/III期试验
◇ 獒合VEGF受体2的单克隆抗体进入临床I期试验 ◇VEGF抗体、VEGF受体的螯合蛋白及反义寡核苷酸 显著抑制视网膜和虹膜血管增生 ◇存在问题：只阻断VEGF的作用仅能部分抑制肿瘤 和血管增生性眼病的血管新生；阻断VEGF的正常 生理作用
调控VEGF表达的信号通路
4. VEGF在细胞内信号传导通路
5. VEGF及其受体在血管新生中的作用和机制 ☆通过增强血管的渗透性,引起血浆蛋白(主要是纤维 蛋白原)的外渗,为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管 网的建立提供了最佳的基质 ☆与受体结合,发挥其特异性的内皮细胞分裂原的活 性，诱导血管内皮细胞的增殖 ☆VEGF提高血浆活化因子和尿激酶类纤维蛋白原活化 因子表达，促进蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因 子的活化，具有促进血管构建作用,诱导血管形成
☆VEGF与其受体结合，通过VEGFRs二聚化，受体酪氨 酸激酶激活，促使底物磷酸化而产生化学趋化性、 促进细胞有丝分裂、肌动蛋白重组、促进内皮细胞 增殖、提高血管通透性、改变细胞外基质的作用
☆VEGF与受体的结合力与受体是否是聚合形式密切相 关，聚合是强大亲和力产生的重要因素 ☆KDR是VEGF发挥主要功能的受体。VEGF与其受体结 合的能力依赖于细胞表面肝素或肝素样分子的存在 ☆KDR在与VEGF的亲和力、结合VEGF后所引起的受体 磷酸化作用、结合后所引起的细胞反应、与肝素的 结合力等许多方面作用都强于F1t-1
☆VEGF121为可溶性分泌蛋白，不与肝素结合，易自由 扩散 ☆VEGF189和VEGF206活性相同，与肝素结合活性很高， 几乎完全与细胞和细胞外基质结合，在细胞外液 中测不到溶解游离形式 ☆虽然5种异构体均能诱导体内的血管生成，但不同 情况下每种异构体发挥不同的优势，何种类型的细 胞产生何种VEGF异构体尚待研究
1. VEGF结构特征
☆VEGF在染色体上定位于6p，为单一基因，长度为 14kb，含8个外显子和7个内含子 ☆VEGF通过两对链间二硫键形成反平行同型二聚体 ☆转录时mRNA可剪接成5种异构体，分别为VEGF121、 VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206 ☆异构体之间功能上的差异表现为它们与细胞表面和 细胞外基质中肝素结合活性不同
◇James Watson 预言人类将在两年内治愈癌症
※ Endostatin作用受到质疑：
◇两个独立的课题组将Endostatin基因导入小鼠体内， 在体内得到了高表达，但高表达的Endostatin既未 能阻断血管增生也未能抑制肿瘤生长 ◇在美国已进行的不到200例病人中至今无一例治愈或 效果显著的报告 ，临床试验结果不理想 ◇美国FDA取消了扩大Endostatin临床试验例数的计划 ◇2002年3月Science 发表评论“setbacks for endostatin”， 认为Endostatin的作用仍具有不确定性，尚需更多的 研究来明确Endostatin自身及其作用 机制
PEDF（pigment epithelium-derived factor）
☆1989年由Tombran-Tink从胎儿视网膜色素上皮细胞 培养液中分离出来，视网膜基质中以较高浓度存在 ☆分子量 50KD，基因位于染色体17p13 ☆属于丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族, 但不具备抗蛋 白酶活性 ☆神经亲和保护作用；抑制血管增生
※应用血管生成抑制因子
目前国外有300多种抑制血管增生的药物处于临床试 验的不同阶段，这类药物大致可以分为5大类： （1）抑制基底膜降解的药物； （2）直接抑制内皮细胞的药物； （3）抑制血管生长因子活化的药物； （4）抑制内皮细胞特异性整合素/生存信号的 药物； （5）其他机理不明但有抗血管增生作用的药物