第2章 菌种的来源及保藏

武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造
方法
基因突变： 自然选育、诱变育种
基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程
基因的直接进化： 点突变、易错PCR、同序法
DNA Shuffling等
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造
一、自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况：
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
物理方法：加热、膜过滤等，表2-2 （P31） 但主要是通过培养的方法
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则
定向培养的富集方法
1、底物
2、pH条件
3、培养时间
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
发酵工程
2
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：
Eli lilly公司,花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
¾富集的三种方案：
z 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。
z 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，
z 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
3
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则
定向培养的方法
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍 三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；
外源基因的导入相对容易；
自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
单细胞(孢子)悬液的制备
平板分离
挑选单菌落 (注意形态的观察)
发酵试验
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
5
菌种的来源
分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等
In contrast to this traditional approach, modern molecular biology
techniques allow for DNA library expression screening, which also
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则
四、菌落的选出
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
z 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 z 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强 z 遗传性能要相对稳定
z 不易感染它种微生物或噬菌体
z 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）
z 生产特性要符合工艺要求
培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强
从285个土样中获得62株
26株为组成型
36株为诱导型
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则
例：醛肟水解酶的筛选--Journal of biotechnology 94(2002), 65-72
培养基中含0.05% of Z-PAOx
每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基
自然界中有目的微生物分离的原则
二、采样时要注意的问题
z 气候、水分、空气 z 来源要广 z 结合产品的特点 z 标签：地点、时间、气候等
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则
三、目的微生物富集的一些基本方法
¾富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
an alkaline soil sample.
FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73～81
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造 第四节 菌株选育、分子改造
目的
z 防止菌种退化
z 解决生产实际问题
z 提高生产能力
z 提高产品质量 z 开发新产品
可寻找已实适应相当苛刻的环境压力的微生物类群。
在酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性 圈的有很大的不同。因此，有可能利用同一生态 环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。
更新的生态环境仍有待进一步的开发，如根瘤、 动物的肠道和其它特殊生态环境。
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
¾ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能；
具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力；
具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；
CHO很少分泌自身的内源蛋白。
武汉科技大学 生物工程教研室
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长
有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自 身的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
微生物的特性及工业微生物的要求
二：工业化菌种的要求
已建立了整套表达理论及技术.
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
(二) 真核细胞表达系统
¾ 酵母(既是微生物又是真核细胞)
z 生长迅速，营养要求不高，易培养；
z 安全性好； z 比哺乳动物细胞操作简单；
z 具有一定的修饰蛋白的能力。
武汉科技大学 生物工程教研室
武汉科技大学·生物工程
发酵工程
菌种的来源
第二章：菌种的来源
微生物的特性及工业微生物的要求
一些工业化产品生产菌种的特点
自然界中有目的微生物分离的原则
菌种选育、分子育种 菌种保藏
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
微生物的特性及工业微生物的要求
第一节 微生物的特性及工业微生物的要求
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离 第三节 自然界中有目的微生物分离
一、菌种分离的一般过程
土样的采取 → 预处理 → 培养 Biblioteka Baidu 菌落的选择
→ 产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现
不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
4
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则 五、目的微生物富集方法的研究进展
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。
2002,陈文新（科学院院士）
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造
自然选育在工业生产上的意义
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
市场调研 文献调研
开发设计
采集样品
原种斜面
菌种保藏机构 提供的纯种斜面
纯种分离
富集培养
筛选(初筛、复筛) 通过筛选的菌种斜面
性能鉴定
菌种保藏
育种出发菌
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
含菌材料选择
选择菌种来源的标准
对于天然材料，如土壤的选择，来源越是广泛的样品 越有可能获得新的菌种；
enables access to enzymes of `nonculturable' organisms. By this strategy,
for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120
unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
第二节 已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
武汉科技大学 生物工程教研室
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
自然界中有目的微生物分离的原则
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）
文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌
采样（造纸厂） →80度30分钟处理 ↓
0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
二、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应 用。
菌株选育、分子改造
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
{ 物理：紫外，快中子
诱变剂 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造
（一）、诱变剂的作用原理（略）
（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
菌株选育、分子改造
（三）、诱变育种的一般步骤
（四）、筛选的方法
随机筛选 形态 理性化筛选
从产物形成的生理生化途径着手，进 行有的放矢的筛选。如结构类似物抗 性、营养缺陷型等，筛选而产生的这 些特性，称为遗传标记。
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
1
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
AK:天冬氨酸激酶
HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成
调节机制
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
已工业化产品生产菌的介绍
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产 物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产 物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。
武汉科技大学 生物工程教研室
发酵工程
菌种的来源
筛选菌株时需考虑的一些指标
A. 菌的营养特征，可利用廉价的原料； B. 菌的生长温度应选择温度高于40℃的菌种，这可
大大降低大规模发酵的冷却成本； C. 菌对所采用的设备和生产过程的适应性； D. 菌的稳定性； E. 菌的产物得率和产物在培养液中的浓度； F. 产物易于从培养液中分离。