第八章 目的基因的分离克隆

TATA盒序列 （-35bp）
ACAAGTCATC ACCCAACAAA TTCACCACCC TATCTTTTCT TACTATTATA TATCAATTTC TCATATATCC AACCCAATAG AAACAATTAT GGCAAGGAAC TCATTCAACT TCCTCATTAT CATGGTCATT TCAGCACTGC TTTTGCTTCC TGGATCACGT GCAAGCTTTC AGGAAAAGAT AACTATGAAC ATAGAAGATG GACGCGAAAG CGGCATAGCA AAGGAAATAG TGGAGGCAGA AGCAGAAGCA GAAGCATTAT TACGCGTTGG TGAGCAAGCT ATGCTGGAAC AAGTAATGAC AAGAGGCTTA GCAGATAACC TTAAGAGGTG TATACCATGT GGTCAAGACT GCATTTCCTC AAGAAACTGT TGCTCACCTT GCAAATGCAA CTTCGGGCCA CCGGTTCCAA GGTGTACTTG AATGCTTAGC TTGCTGCTAA GTGCTAAGTG CTAAGCGCTA GCCTTGCTAG TATGTACACG ATCCGCTCTA TCTCTTTATA TATGCACCTA AGTCCTCTCA GTTTCAACTT TCATCTCGAT CTGTATGTGT TGTTTAATTT GTGTGTAAAA TAAAGTCTTG GTTTTCCAAG ACTAGTTATG TTACTGGCTG CGCTTATGTT TTTCGAATCT TGATATATAA AA TAAA ATAAGACAAG GAGACCTATT TCTTGCTTTG GTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA



以特异的寡核苷酸为引物 PCR反应采用两个特异引
物，cDNA第一链的合成与mRNA3’端最靠近的配对引
物Baidu Nhomakorabea始。

用特异引物引发cDNA第一链合成的好处是仅产生需
要的cDNA，并导致更为特异的PCR扩增。
用RT-PCR扩增目的基因的方法
二、PCR克隆已知序列旁侧的未知片段

cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功 能的研究至关重要。在分离一种新转录的cDNA拷贝时， 往往得到的cDNA克隆只是原mRNA的部分序列。
cDNA末端的快速克隆（RACE技术）
一）经典RACE



RACE技术是通过以mRNA为模板反转录成cDNA第一链 后，用PCR方法实现从基因内部某个特定位点到3‘端 或5’端之间未知序列克隆，因而有5‘－RACE和3’ －RACE。 3’－RACE策略： 以带有Q0、Q1引物序列的oligo（dT) 的引物QT为反转 录引物合成cDNA第一链 以Q0和基因特异性引物（GSP1）进行首次PCR扩增 以Q1和基因特异性引物（GSP2）为巢穴引物进行嵌套 式PCR扩增，获得所需的3‘端目的片段。
32
3 结果与分析
3′RACE 和5′RACE测序结果与靶序列DP3的双拼接 ：
应用DNAMAN 4.0 Sequence Assembly 程序将3′RACE 和5′RACE测序结果与靶序列DP3 进行双拼接，获得693bp片段，结果如下：
起始密码子 （88bp）
1 81 161 241 321 401 481 561 641
第八章


目的基因的分离克隆
第一节 PCR技术在植物基因克隆中的应用 第二节 基因文库技术分离目的基因 第三节 mRNA差别显示技术分离差别表达基因
第一节 PCR技术在植物基因克隆中的应用

PCR技术直接扩增克隆目的基因
PCR技术克隆已知序列旁侧的未知片段 PCR技术克隆新的未知基因
一、PCR直接扩增克隆目的基因

意义：

使生物的遗传信息以稳定的重组体形式储存起来； 分离克隆目的基因的主要途径； 是复杂基因组作图的重要依据。 基因的克隆； 克隆基因的分离； 分离基因的鉴定。
文库分离目的基因的主要内容：

一）类别


根据基因类型分：基因组文库和cDNA文库；
根据文库功能分：克隆文库和表达文库； 根据构建文库的载体分：质粒文库、噬菌体文库； 黏粒文库；人工染色体文库。
新RACE与经典RACE比较
新RACE图示
3 结果与分析 3．2 cDNA末端快速扩增（RACE）
1 2 3 M 1 2 3 4 5 M M 1 2 3 4
300bp 500bp 图3-11 5′RACE第一次 PCR扩增产物的琼脂糖凝 胶电泳 M：DNA Ladder ；1～ 5：5′RACE扩增产物； 图3-12 5′RACE巢式PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶 电泳 M：DNA Ladder ；1～ 4：巢式PCR扩增产物；

基因组文库：是指某生物的全部基因组DNA切割成一 定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA 经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克 隆的集合。 cDNA文库具有时效性 cDNA文库只反应mRNA的分子结构

两者区别：

31
3 结果与分析
5′RACE扩增产物测序
1 61 121 181 GGGGGGGGGG ATTATATATC TCAACTTCCT GCTTTCAGGA GGGGGGACAA AATTTCTCAT CATTATCATG AAAGATAACT GTCATCACCC ATATCCAACC GTCATTTCAG ATGAACATAG AACAAATTCA CCACCCTATC TTTTCTTACT CAATAGAAAC AATTATGGCA AGGAACTCAT CACTGCTTTT GCTTCCTGGA TCACGTGCAA AAGATGAG

克隆文库：由克隆载体构建。载体中具有复制子、多 克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大 量增殖。

表达文库：是用表达载体构建。载体中除克隆文库的 元件外，具有控制基因表达的序列（如启动子、SD序 列等），可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物 筛选：从克隆文库分离某的基因主要利用核酸探针； 从表达文库分离某的基因除利用核酸探针外，还可以 利用免疫学探针及生物功能进行筛选。

运用反向PCR、锅柄PCR(Panhandle PCR)、连接介导PCR 等PCR技术及cDNA文库筛选技术为扩增已知序列旁侧的 未知DNA片段提供了捷径。然而,这些方法实验周期长、 费用高，而且常出现PCR扩增效率或特异性低等问题。 因而利用这些方法很不容易得到完整的全长基因，尤其 是基因的5′-端。
图3-10 3′RACE扩增产物 的琼脂糖凝胶电泳 M：DNA Ladder ；1～3： 3′RACE扩增产物；
3 结果与分析
3′RACE扩增产物测序
1 61 121 181 241 301 361 421 AATAGTGGAG GGAACAAGTA AGACTGCATT TCCAAGGTGT GCTAGTATGT AACTTTCATC CCAAGACTAG ACAAGGAGAC GCAGAAGCAG ATGACAAGAG TCCTCAAGAA ACTTGAATGC GCACGATCCG TCGATCTGTA TTATGTTACT CTATTTCTTG AAGCAGAAGC GCTTAGCAGA ACTGTTGCTC TTAGCTTGCT CTCTATCTCT TGTGTTGTTT GGCTGCGCTT CTTTGGTTAA ATTATTACGC TAACCTTAAG ACCTTGCAAA GCTAAGTGCT TTATATATGC AATTTGTGTG ATGTTTTTCG AAAAAAAAAA GTTGGTGAGC AGGTGTATAC TGCAACTTCG AAGTGCTAAG ACCTAAGTCC TAAAATAAAG AATCTTGATA AAAAAAAA AAGCTATGCT CATGTGGTCA GGCCACCGGT CGCTAGCCTT TCTCAGTTTC TCTTGGTTTT TATAAATAAG

PCR直接扩增克隆是一种参考已知基因序列克隆基因 的方法。目前已知很多植物基因的序列，当克隆类似 基因时，可先从Genebank库中找到有关基因序列，用 PCR方法克隆不同植物的基因。
一）从基因组DNA扩增目的基因




根据已知基因的序列，设计并合成一对引物；（知道 氨基酸序列，可以根据推测的碱基序列设计简并引物） 从植物中提取DNA进行PCR扩增； 扩增片段的纯化； 酶切纯化的扩增片段及载体，并回收酶切片断； 将两片段用连接酶连接； 重组体转化大肠杆菌； 用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序 列进行比较；
cDNA合成的引物

cDNA第一链的引物主要由RT-PCR的特定用途所决定， 可由三种反式引发：
以oligo（dT)为引物 可与mRNA分子3‘末端的poly （A）序列相结合，有效的引发cDNA第一链的合成， 对mRNA具有高效的特异性； 对较长序列的mRNA（大于3kb）分子，则较难得到全 长的cDNA。



以随机六聚体的核苷酸为引物 1）当特定mRNA中由 于含有使反转录酶终止反应的序列；2) mRNA分子较大 且3‘端非编码区序列较长难以得到全长序列的cDNA或 完整的读码框时。
当使用随机引物时，cDNA第一链的合成可能起始于 mRNA上的许多部位，从而保证得到mRNA的编码区和 5‘端旁侧； 所有的RNA都可以作为cDNA第一链合成时的模板。
5‘-RACE策略：

以基因特异引物（GSP-RT）将mRNA特异性反转录为 cDNA第一链； 在cDNA第一链3‘端加入poly（A）尾； 以QT和GSP1进行首次扩增；

以Q1和GSP2进行第二次扩增，最后获得5‘端目的片 段。
经典RACE原理示意图
二) 新RACE



一般的5‘－RACE技术中存在的最困难的一步诱导反转 录酶将目的mRNA反转录成完整的cDNA第一链。 经典RACE中反转录过程的提前终止导致非全长第一链 cDNA的多聚腺苷化，并在PCR中全部扩增，全部cDNA 在PCR中均能扩增，产生非全长cDNA5’末端，从而给实 验带来一定难度。 新RACE技术不同之处在于，锚定引物在反转录之前就 连接到mRNA的5‘末端，因此，只有通过目的mRNA5’ 端全长的反转录物，锚定序列才能整合到cDNA第一链 中.
AATAAA加 尾信号
终止密码子 （419bp）
polyA尾
第二节


基因文库技术分离目的基因
基因文库的类别 植物核基因组文库构建 植物cDNA文库构建 利用PCR技术构建植物cDNA文库
一、基因文库类别

基因文库：是指某一生物类型全部基因的集合。（这 种集合是以重组体形式出现） 某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿 主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落 （或噬菌斑）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片 段克隆的集合即为该生物的基因文库。
二）从cDNA中扩增目的基因（RT-PCR）

对己知cDNA序列的目的基因可通过RT-PCR技术得到 其所需片段。cDNA第一链的合成应根据mRNA序列的 复杂性及所扩增区域的特性不同选取适宜的反转录酶 和引发的引物。采用合理的策略和技术路线进行。当 反转录完成后，以反转录所得的cDNA第一链为模板， 特异引物进行特异性PCR扩增。
基本原理





用牛小肠磷酸酶（CIP）对mRNA脱磷酸化，脱磷酸化 的作用只对降解的mRNA有效而对全长的mRNA无效； 用烟草酸性焦磷酸酶（TAP）处理全长mRNA使其脱帽， 即可使全长mRNA5’端带上活化的磷酸基团； 用T4RNA连接酶将其与一段由线性化质粒体外转录产 生的特异RNA寡核苷酸相连； 用基因特异引物或随机引物对RNA寡核苷酸－mRNA杂 合体进行反转录产生cDNA第一链； 用基因特异引物和RNA寡核苷酸特异引物进行PCR扩增， 从而获得5‘端未知序列。