膜片钳讲课学习资料
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细胞准备：其它来源
来源于培养细胞：直接蛋白酶消化 来源于人心肌手术标本剪刀剪碎，蛋
白酶＋胶原酶孵化
电极要求
尖端1－2μm（加热拉制） 电阻2－4欧姆（双步拉制） 尖端光滑（热抛光） 电极内充填（电极内液）细胞内液 尖端无气泡、灰尘 电极内有银丝与膜片钳系统相连接 电极由液压三维操纵器操纵（精确致μm）
膜片钳技术简介
丁仲如
Molecules vs. circuits
Bilayer
= capacitor
Ion gradient = battery Channel = conductance
Out
GK CM
EK
In
Structure of Na+ Channel
Methods for studying ion channels
术 枪乌贼巨突轴动作电位 1963年诺贝尔医学或生理学奖 1980－1981年 Neher、sakeman 膜片钳技术 1991年诺贝尔医学或生理学奖
电压钳技术（voltage clamp )
钳制细胞膜电位于指定水平（反馈电 路）
改变电压敏感性离子通道的开放或关 闭
欧姆定律：Im＝g×Vm 膜电导（膜对离子通透性，g） 膜电位（Vm） 膜电流（ Im)
Functional
• Current clamp (record membrane potential) • Voltage clamp (record ionic currents)
Macroscopic 2-electrode Whole-cell patch clamp
Microscopic (single channels) Cell-attached Inside-out Outside-out
液压三维操纵器
accueil
techniques
Electrodes
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
accueil
techniques
culture
全细胞记录示意图
tranches
electrodes
equipement
scellement
CO I
膜片钳技术
要求电极与细胞良好封接 减少电极尖端与细胞膜之间产生漏流，
以减少背景噪音 措施：小膜片；电极双步拉制；尖端
热抛光； 50M欧姆 负压吸引：偶然发现，使阻抗达109欧
姆（giga seal ）
Patch clamp recording
Suction
Glass microelectrode
双微电极，要求细胞大，细胞小不能进行 背景噪声大（1000pA） 无法记录单个离子通道（1－2pA）
Open channel block
Closed
Open
Blocked
CO B
OB
Ball-and-chain model for inactivation
Closed
Open
Inactivated
电压钳技术
Action potential – squid giant axon
mV ENa
40
0 Voltage
-40
-80 40 mS cm2 0 Stimulus
GNa GK
Vrest EK
2 ms
Conductance
电压钳技术
首次记录了动作电位及离子通道电流 Hodgken－Huxley电压门控动力学模型 缺点：
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
Comment obtenir des tranches de cerveau
scellement
Human Atrial Cardiomyocyte
Human Ventricular Cardiomyocyte
CELL-ATTACHED
INSIDE-OUT
Pull
Suction
Pull
Cell-attached patch-clamp recording
Whole-cell patch-clamp recording
单通道记录
记录单个离子通道开放或关闭 通道门控动力学分析
膜片钳负反馈放大器 Data/digital adapter 玻璃微电极操纵系统 Pclamp 软件系统：发放脉冲、采
集数据、分析数据
accueil
techniques
Les Appareils
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
•Leur fonctionnement •Pour en savoir plus sur les amplis opérationnels
• Gating current • Spectroscopy
Structural
• Biochemistry • Molecular biology • StructHale Waihona Puke Baidural (x-ray, etc.
离子通道研究简史
1903年 Einthoven 第一份体表心电图 1952年Hodgken、Huxley 电压钳技
1 µm Cytoplasm
"Giga-seal"
Ion channels
Cell membrane
膜片钳技术
利用一个微电极同时完成膜片或全细 胞电位的监测、钳制和膜电流的记录
通过膜电流的变化分析个体或群体离 子通道分子的电活动
精度：电流1pA（10－9A） 时间：10mS 空间：1μm
膜片钳系统组成
enregistré.
膜片钳记录四种模式
全细胞记录：whole cell recording 单通道模式
cell attached 外面向外：outside out 内面向外：inside out
Patch clamp configurations
OUTSIDE-OUT
WHOLE-CELL
Human Liver Fibroblasts
Human Aortic Endothelial Cells
[5, 13, 14]
细胞准备：来源于动物
双酶酶解分离法（胶原酶＋蛋白酶） 心脏冰盐水主动脉逆行插管 langendoff灌流装→置台氏液 无钙台氏液→低钙胶原酶台氏液灌流 剪成1mm大小心肌碎片→蛋白酶孵化
细胞准备：其它来源
来源于培养细胞：直接蛋白酶消化 来源于人心肌手术标本剪刀剪碎，蛋
白酶＋胶原酶孵化
电极要求
尖端1－2μm（加热拉制） 电阻2－4欧姆（双步拉制） 尖端光滑（热抛光） 电极内充填（电极内液）细胞内液 尖端无气泡、灰尘 电极内有银丝与膜片钳系统相连接 电极由液压三维操纵器操纵（精确致μm）
膜片钳技术简介
丁仲如
Molecules vs. circuits
Bilayer
= capacitor
Ion gradient = battery Channel = conductance
Out
GK CM
EK
In
Structure of Na+ Channel
Methods for studying ion channels
术 枪乌贼巨突轴动作电位 1963年诺贝尔医学或生理学奖 1980－1981年 Neher、sakeman 膜片钳技术 1991年诺贝尔医学或生理学奖
电压钳技术（voltage clamp )
钳制细胞膜电位于指定水平（反馈电 路）
改变电压敏感性离子通道的开放或关 闭
欧姆定律：Im＝g×Vm 膜电导（膜对离子通透性，g） 膜电位（Vm） 膜电流（ Im)
Functional
• Current clamp (record membrane potential) • Voltage clamp (record ionic currents)
Macroscopic 2-electrode Whole-cell patch clamp
Microscopic (single channels) Cell-attached Inside-out Outside-out
液压三维操纵器
accueil
techniques
Electrodes
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
accueil
techniques
culture
全细胞记录示意图
tranches
electrodes
equipement
scellement
CO I
膜片钳技术
要求电极与细胞良好封接 减少电极尖端与细胞膜之间产生漏流，
以减少背景噪音 措施：小膜片；电极双步拉制；尖端
热抛光； 50M欧姆 负压吸引：偶然发现，使阻抗达109欧
姆（giga seal ）
Patch clamp recording
Suction
Glass microelectrode
双微电极，要求细胞大，细胞小不能进行 背景噪声大（1000pA） 无法记录单个离子通道（1－2pA）
Open channel block
Closed
Open
Blocked
CO B
OB
Ball-and-chain model for inactivation
Closed
Open
Inactivated
电压钳技术
Action potential – squid giant axon
mV ENa
40
0 Voltage
-40
-80 40 mS cm2 0 Stimulus
GNa GK
Vrest EK
2 ms
Conductance
电压钳技术
首次记录了动作电位及离子通道电流 Hodgken－Huxley电压门控动力学模型 缺点：
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
Comment obtenir des tranches de cerveau
scellement
Human Atrial Cardiomyocyte
Human Ventricular Cardiomyocyte
CELL-ATTACHED
INSIDE-OUT
Pull
Suction
Pull
Cell-attached patch-clamp recording
Whole-cell patch-clamp recording
单通道记录
记录单个离子通道开放或关闭 通道门控动力学分析
膜片钳负反馈放大器 Data/digital adapter 玻璃微电极操纵系统 Pclamp 软件系统：发放脉冲、采
集数据、分析数据
accueil
techniques
Les Appareils
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
•Leur fonctionnement •Pour en savoir plus sur les amplis opérationnels
• Gating current • Spectroscopy
Structural
• Biochemistry • Molecular biology • StructHale Waihona Puke Baidural (x-ray, etc.
离子通道研究简史
1903年 Einthoven 第一份体表心电图 1952年Hodgken、Huxley 电压钳技
1 µm Cytoplasm
"Giga-seal"
Ion channels
Cell membrane
膜片钳技术
利用一个微电极同时完成膜片或全细 胞电位的监测、钳制和膜电流的记录
通过膜电流的变化分析个体或群体离 子通道分子的电活动
精度：电流1pA（10－9A） 时间：10mS 空间：1μm
膜片钳系统组成
enregistré.
膜片钳记录四种模式
全细胞记录：whole cell recording 单通道模式
cell attached 外面向外：outside out 内面向外：inside out
Patch clamp configurations
OUTSIDE-OUT
WHOLE-CELL
Human Liver Fibroblasts
Human Aortic Endothelial Cells
[5, 13, 14]
细胞准备：来源于动物
双酶酶解分离法（胶原酶＋蛋白酶） 心脏冰盐水主动脉逆行插管 langendoff灌流装→置台氏液 无钙台氏液→低钙胶原酶台氏液灌流 剪成1mm大小心肌碎片→蛋白酶孵化