实验四农杆菌转化烟草和拟南芥
烟草遗传转化实验报告
烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
02
01
03
学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
04
05
等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
01
02
03
04
将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
农杆菌侵染拟南芥
拟南芥侵染方法：
1、取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜
至培养基由红色转为黄色。
2、将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min
3、弃上清，加入50ml 1／2 MS，将菌泥搅起
4、将培养4周左右,刚开花的拟南芥植株上的果荚去除，将上面准备好的菌液倒入培养皿
中，将整个花序浸入菌液10sec
5、将浸好的拟南芥植株在黑暗条件下，处理18-24h后继续光照，一周后可再dip一次
用于Dip的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）
MS大量5 ml
蔗糖10 g
水95 ml
表面活性剂20 ul
常用1／2 MS配方（1 L）：
10X大量元素50 ml
100X微量元素 5 ml
100X铁盐 5 ml
蔗糖（1%）10 g
琼脂粉8 g
拟南芥生长土壤：
腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟
注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。
种子消毒：
30%H2O2+85%乙醇1:4混合
取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2 MS平板上。
4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。
16\8 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。
营养土产家：吉林省德惠市芳洁花土厂(花卉营养土) 我们是从北京际翔园艺花圃公司买的。
农杆菌注射烟草转化
农杆菌注射烟草转化编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（农杆菌注射烟草转化）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为农杆菌注射烟草转化的全部内容。
农杆菌注射烟草实验步骤农杆菌转化1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管,电击杯，移液枪，枪尖等）.★感受态易失效，准备工作须充分2.吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡)，放入电击仪（调manal 至1。
6—1。
7）。
3.电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4.28℃,摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备)。
5.涂板，(使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。
6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功,同时做菌种保藏（根据实验需要）.接菌注射1. 挑菌转接3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。
★玻璃试管摇菌效果要好些2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，(20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS+500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5.●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ，10min 弃上清.4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ），现配现用。
用等量缓冲液重悬菌液。
一份等量,一份少量5. 调菌液OD 值至1。
0，室温放置1h 。
将需要混合的菌液等体积混合,可注射。
转Mn-SOD基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究
中国农业大学博士学位论文转Ｍｎ－ＳＯＤ基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究摘要盐、渍、干旱和低温等逆境胁迫是农业减产的重要原因。
长期而严重的环境胁迫会引起植物体内活性氧的积累，导致氧化胁迫，给细胞乃至整个植株带来严重伤害。
ＳＯＤ被认为是细胞内的维持活性氧平衡的关键酶，它能快速清除超氧阴离子，防止毒性最强的羟自由基的生成，清除活性氧的毒害。
Ｍｎ—ＳＯＤ位于真核细胞的线粒体中，尽管人们早己认识到线粒体是盐胁迫下最易受到伤害的细胞器之一，但是对于植物的线粒体内Ｍｎ．ＳＯＤ在盐胁迫条件下的适应性调节及其在植物耐盐性中作用还未有详尽的报道，而且在目前有限的研究结果中还存在很多的分岐。
为此本研究构建了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下的Ｍｎ．ＳＯＤ重组质粒，通过农杆菌的介导获得了转Ｍｎ－ＳＯＤ的拟南芥和烟草。
通过比较野生型与转基因的拟南芥和烟草的耐盐性、Ｍｎ—ＳＯＤ和其它抗氧化酶类活性和ＭＤＡ含量的差异、以及它们在盐适应反应中的变化，阐明Ｍｎ．ＳＯＤ在维持细胞内活性氧的平衡、保护细胞免受活性氧的伤害中的作用，为进一步改造植物耐盐品种提供理论依据。
／～√采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆得到拟南芥Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列，并构建Ｍｎ－ＳＯＤ片段的原核表达载体，获得融合蛋白并制备抗体，抗体效价为１：１００００。
同时以Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列构建真核生物表达载体，分别转化拟南芥和烟草，通过ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＳＯＤ活性鉴定，得到阳性转基因植株。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定转基因植株的线粒体中有外源的Ｍｎ—ＳＯＤ的表达。
野生型拟南芥和烟草组培苗经不同浓度ＮａＣＩ胁迫处理１５天后，发现拟南芥在】５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下烟草在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下植株遇到明显伤害，生长受到抑制。
检测叶片Ｍｎ．ＳＯＤ活性，结果表明拟南芥和烟草叶片中Ｍｎ．ＳＯＤ活性受盐胁迫调节，在一定盐浓度范围内（烟草１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、拟南芥１００ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｍｎ—ＳＯＤ活性与盐胁迫程度正相关。
农杆菌侵染拟南芥方法
农杆菌侵染拟南芥方法植株准备：养的壮壮的，可以适时打顶，剪掉顶端，长更多侧枝。
1.冻融法转化农杆菌1.1 目的质粒与农杆菌GV3101感受态混匀，冰上共孵育5-30min, 液氮中冻5min, 37℃5min, 冰上2min, 加入无抗性LB 28℃恢复培养2-4h, 涂相应抗性板，28℃培养24-48h.2. 摇菌2.1 PCR鉴定单克隆，挑选阳性单克隆接入2-3ml相应抗性LB中，小摇至橙黄色，约24-48h。
如果是保种的菌，最好也要小摇。
2.2 按0.5%-1%接种量接入~150ml相应抗性LB中，过夜至橙黄色。
2.3 收菌，5000rpm,10min（最好用250ml的离心瓶，50ml的离心管也可）。
菌体沉淀用等体积（大摇菌的LB体积, 不是沉淀的体积，收菌的时候在瓶子上画个线即可）5%蔗糖溶液（水溶）重悬，手晃、枪吹打、涡旋均可。
加入~0.1% （0.5‰上下100倍均可）Silwet,摇匀。
3.侵染3.1 待侵染的植株剪去果荚和开放的花。
植株在前一天浇足水。
（可侵染前一天剪，不剪也是可以的）3.2侵染液（5%蔗糖重悬的菌液）倒入比较浅的容器（枪头盒盖子、15cm培养皿或其他类似盒子均可）中。
3.3将保鲜膜铺在桌子上或地上，将植株的花序和茎（茎上的腋芽）浸入侵染液，静置30-60s,拿出放置于保鲜膜上，包起来（包住盆的一部分和植株全部），平着放入黑色塑料袋内或者盆内（遮光即可）。
18-22h后，揭去保鲜膜，正着放置生长即可。
如此时发现还有明显菌液，可晃一晃去除，令植株的花序不要黏在一起。
揭保鲜膜最好不要超过20h, 超过24h，花序蔫掉的比率会大大增加。
3.4 侵染后7-10天后可以进行第二次侵染。
这次坚决不能剪果荚和花二次侵染前提是植株的花序顶端还很壮，还能开好多花，否则就等着花序蔫掉吧，切记切记。
拟南芥转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。
2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。
3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。
转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。
本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。
实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。
将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。
将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。
将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
转基因拟南芥实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。
2. 学习拟南芥转基因方法，包括农杆菌介导转化和基因枪法。
3. 鉴定转基因植株，并分析其遗传稳定性。
二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株（野生型、突变型）2. 农杆菌菌株（如Agrobacterium tumefaciens C58）3. 转基因载体（含目的基因、抗生素抗性基因）4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆：根据目的基因序列设计引物，从基因库中克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：将目的基因克隆到载体上，并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。
3. 农杆菌转化：将转基因载体转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株，筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否成功插入。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性。
四、实验结果与分析1. 目的基因克隆：成功克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：成功构建转基因载体，并插入抗生素抗性基因。
3. 农杆菌转化：成功转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：通过喷洒或浸泡转化介质，成功筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，成功检测到目的基因。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性，结果表明转基因植株遗传稳定性良好。
五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法，具有操作简便、转化效率高等优点。
2. 在转基因过程中，抗生素抗性基因作为筛选标记，可以有效筛选出转基因植株。
3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段，可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。
4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节，有助于确保转基因植物的安全性。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥
• 小量培养农杆菌16-24 h；按1:100转接到培养液(5 mL YEP，100 µM乙酰
丁香酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL） 接种与活化 中，28 °C16-24 h
诱导
• 当菌摇到OD6001.0时，5 000 rpm 10 min收集菌体，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 μL 100 mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD6001.0，室温静置 至少3 h
侵染
• 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香 酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件下培养2d。
a
注射法瞬时转化烟草
• 种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25 °C，16 h光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
• 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽 转化 真空10 min
• 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2 d后去除塑料膜，培养至
培养
种子成熟
a
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基 (Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
a
操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项 抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验 新鲜的叶片转化效率高 侵染前去除拟南芥已开花和果荚 侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长 侵染后共培养一般为暗培养，1~2d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。
拟南芥AP3基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化-2019年文档
拟南芥AP3基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化花是被子植物的重要生殖器官。
花器官的发育模型最早源于Coen和Meverowitz对拟南芥和金鱼草的研究，并提出了花发育的“ABC”模型，随后该模型被后人逐步发展为“ABCD”或“ABCE”模型。
典型的花发育具体可分为四轮，分别为萼片、花瓣、雄蕊和心皮，每一轮的发育都受相应基因的特异性调控。
隶属于MADS-box家族的植物花器官B类特征基因在雄蕊及花瓣发育中行使功能。
研究表明，B类功能基因在花器官发育时与C类功能基因共同控制雄蕊发育，同时又与A类功能基因共同调控花瓣发育，当B类功能基因缺失，雄蕊会转化为心皮，花瓣则转化为萼片，形成只有心皮和萼片的不完整花器官。
B类功能基因在植物进化过程中发生了两次基因重复事件，结果在这个亚家族中产生了四个不同的进化系，分别为DEF/AP3（paleoAP3）、GLO/PI、TM6和euAP3。
其中拟南芥经历基因重复后，其B类功能基因产生了属于euAP3进化系成员的APETAIA3（AP3）基因和属于GLO/PI进化系成员的PISTELIATA（PI）基因。
目前对花器官发育的研究大多以“ABC”模型为理论基础来丰富其他物种的花器官发育机制，关于拟南芥AP3基因在烟草中异源表达的研究报道较少。
本试验根据拟南芥B类功能基因的高度保守性及组织表达特异性，从拟南芥花序中克隆得到AtAP3基因，构建植物表达载体并进行烟草遗传转化。
不仅对植物花器官B类特征基因AP3的功能进行了新的补充，还增加了对植物花发育“ABC”模型的新认识。
1 材料与方法1.1 试验材料野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）、野生型烟草（Nicotiana tobacum）种子均为本实验室保存。
1.2 菌株及主要试剂大肠杆菌Transl-T1感受态购自Transgen（中国）；农杆菌EHA105由本实验室保存；植物表达载体pROKII质粒，由山东师范大学张慧教授惠赠；质粒提取、胶回收试剂盒购自OMEGA公司（美国）；PCR相关试剂、DNA marker、限制性内切酶、T4 DNA ligase、PrimeScriptrrM RT reagent Kit购自TaKaRa公司（中国大连）；EasyPureTM PlantRNA Kit、pEASY-T1购自Transgen （中国）；其他试剂为进口或国产分析纯。
basta筛选拟南芥的原理
basta筛选拟南芥的原理
Basta筛选拟南芥的原理是基于转基因技术。
首先，通过农杆菌转化法将含有激活标记质粒pSK1015的农杆菌直接喷雾进行转化拟南芥，构建拟南芥的激活标记突变体库。
然后，以抗除草剂Basta为筛选标记，对转化后的拟南芥进行筛选。
在筛选过程中，不同时期喷洒不同浓度的Basta，以观察其对拟南芥生长的影响。
研究发现，拟南芥转化体刚长出2叶时比较敏感，此时开始喷施Basta效果比较好。
同时，PPT含量为135%的情况下，稀释2000～4000倍喷施效果好，此时既可有效筛选出阳性苗，又不会抑制阳性苗的生长。
第一次喷施后6天左右移栽阳性苗较好，此时可以明显区分出阳性苗，且移栽后缓苗快、长势好。
因此，Basta筛选拟南芥的原理是基于转基因技术，通过抗除草剂Basta作为筛选标记，筛选出具有抗性的阳性苗。
通过合理控制喷施时间和浓度，可以有效筛选出拟南芥的抗性阳性苗，为进一步的研究和应用提供基础。
拟南芥转化流程
拟南芥转化流程拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。
拟南芥转化是指将外源基因导入拟南芥的过程，通过转化技术，可以使拟南芥表达特定的基因，从而研究基因功能、调控机制以及植物生长发育等方面的问题。
下面将详细介绍拟南芥转化的流程。
一、前期准备工作在进行拟南芥转化之前，首先需要准备一些实验材料和试剂。
这些包括拟南芥种子、培养基、细菌菌株、质粒载体等。
同时还需要准备一些实验器材，如离心管、琼脂糖凝胶、PCR仪等。
二、质粒构建在进行拟南芥转化之前，需要构建含有目标基因的质粒。
质粒通常由多个部分组成，包括启动子、目标基因、选择标记等。
在构建质粒时，需要使用PCR技术扩增目标基因，并经过酶切、连接、转化等步骤，最终得到完整的质粒。
三、细菌转化和筛选构建好的质粒需要通过细菌转化来扩增。
将质粒导入适当的细菌菌株中，利用培养基和培养条件培养细菌，使其扩增质粒。
之后，通过筛选等手段，得到含有目标质粒的细菌菌落。
四、DNA提取和验证从筛选出的细菌菌落中提取质粒DNA，可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行提取。
提取得到的DNA需要进行酶切鉴定，通过PCR扩增目标基因进行验证。
同时，还可以使用限制性片段长度多态性（RFLP）等技术对质粒进行进一步的验证。
五、拟南芥转化得到验证合格的质粒后，就可以进行拟南芥转化了。
常用的转化方法有农杆菌介导法和冷冻法。
在农杆菌介导法中，将构建好的质粒导入农杆菌中，然后将农杆菌与拟南芥叶片进行共培养，利用农杆菌的侵染能力将质粒导入拟南芥细胞中。
而冷冻法则是将拟南芥种子与农杆菌共同处理，通过冷冻和解冻的过程，使质粒导入拟南芥种子中。
六、筛选和培养转化完成后，需要对转化成功的拟南芥进行筛选和培养。
通常会在培养基中添加适当的选择标记，如抗生素等，以筛选出含有目标基因的拟南芥植株。
筛选出的植株可以继续培养，在适当的生长条件下进行生长发育观察和功能验证。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
农杆菌转染烟草(陈泠)
4.1. 农杆菌转化烟草所需培养基和试剂（1）YEB液体培养基：蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蔗糖 5.0 g/L，MgSO4 0.5g/L，调pH至7.2~7.5，高压灭菌。
（固体培养基每升加15g琼脂，）（2）链霉素（Str）、卡那霉素（Km）：贮存液浓度为50 mg/mL，溶于双蒸水中，0.22 μm滤膜过滤后分装，–20℃保存。
（3）羧苄青霉素（Cb）和头孢霉素（Cef）：贮存液浓度为500 mg/mL，溶于双蒸水中，0.22 μm滤膜过滤，–20℃保存。
（4）6-氨基嘌呤（6-BA）和ａ-萘乙酸（NAA）：各取20mg，先用少量1 mol/L NaOH溶解，再加蒸馏水至1 mL，最好现用现配。
（5）烟草转化所用的培养基共培养培养基：MS+ 6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L分化培养基：MS+ 6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+ Cb 500mg/L+Kan 100 mg/L 生根培养基：1/2MS + Kan 100 mg/L+ Cef 250mg/L（1/2MS是指MS大量元素减半）4.3.1 农杆菌LBA4404感受态的制备（1）取100 μL农杆菌LBA4404，接种于5 mL LB液体培养基（含50 mg/L Str）中，28℃、200 rpm暗培养过夜；（2）取2 mL培养的菌液于50 mL YEB液体培养基（含50 mg/L Str）中继续培养，直至OD600值为0.4左右；（3）将培养好的菌液在冰块中冰浴30 min，然后4℃，5,000 rpm离心5 min，弃去上清液；（4）加入10 mL预冷的20 mmol/L CaCl2悬浮菌体，尽量打散菌体，使菌体充分悬浮，有助于制备较高效率的感受态；（5）4℃，5,000 rpm离心5 min，弃去上清液，尽量去净液体；（6）用1 mL预冷的20 mmol/L CaCl2悬浮菌体，分装成100 μL/管，在液氮中冷冻后放于–70℃保存。
做遗传转化实验报告
实验日期：2023年10月15日实验目的：1. 掌握遗传转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞，并观察转化效果。
3. 了解转化频率、表达效率等遗传转化相关指标。
实验原理：遗传转化是指将外源基因通过一定的方法导入受体细胞，使其在细胞内表达的过程。
植物细胞遗传转化通常采用农杆菌介导法，利用农杆菌的Ti质粒将外源基因整合到受体细胞的染色体上。
本实验以拟南芥为受体植物，将绿色荧光蛋白（GFP）基因导入其中，观察转化效果。
实验材料：1. 拟南芥种子2. 农杆菌菌株：E. coli DH5α3. 农杆菌菌株：Agrobacterium tumefaciens GV31014. GFP基因质粒：pBI1215. 抗生素：卡那霉素、氯霉素6. 实验器材：超净工作台、离心机、移液器、消毒液、培养皿、培养箱等实验步骤：1. 种子消毒：将拟南芥种子用70%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次。
2. 农杆菌活化：将E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens GV3101分别接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。
3. 质粒提取：按照试剂盒说明书提取pBI121质粒。
4. 农杆菌转化：将活化后的Agrobacterium tumefaciens GV3101与pBI121质粒混合，37℃培养3小时。
5. 拟南芥接种：将消毒后的拟南芥种子接种于含有农杆菌的培养基中，28℃暗培养3天。
6. 转化植株筛选：将接种后的拟南芥转移到含有抗生素的培养基上，筛选转化植株。
7. GFP表达检测：将转化植株置于紫外灯下观察GFP表达情况。
实验结果：1. 成功转化拟南芥植株，转化频率约为10%。
2. 转化植株中，GFP表达率为100%。
讨论与分析：1. 本实验采用农杆菌介导法成功将GFP基因导入拟南芥细胞，转化频率较高。
2. 转化植株中GFP表达率为100%，说明外源基因在拟南芥细胞中得到了有效表达。
拟南芥模拟植物实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。
由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。
本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。
二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。
2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。
3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。
三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。
（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。
（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。
2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。
（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。
（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。
3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。
（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。
（3）记录生长数据，分析生长规律。
4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。
（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。
（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。
五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。
2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。
3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。
转拟南芥CAO基因烟草的构建及弱光耐受性分析
转拟南芥CAO基因烟草的构建及弱光耐受性分析张伟;李翠萍;张兴国;张煜【摘要】[目的]探讨转拟南芥叶绿素酸酯a加氧酶(Chlorophyllide a oxygenase,AtCAO)基因烟草的耐弱光性,以明确AtCAO基因能否提高烟草对弱光的捕获能力,为其他作物的耐弱光性改良提供参考.[方法]将AtCAO基因克隆、构建表达载体后,通过农杆菌介导法导入烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Wisconsin 38),弱光处理后,测定叶绿素、光合速率、株高等相关指标.[结果]农杆菌介导法转化烟草后,提取抗卡那霉素(Kan)烟草与野生烟草基因组DNA,PCR检测证明抗Kan烟草含有AtCAO基因,且无农杆菌污染,说明获得了整合有AtCAO基因的烟草植株;弱光处理后,发现转AtCAO基因烟草的叶绿素a含量增加23.5％～38.1％,叶绿素b 含量增加40.0％～54.3％,叶绿素总量增加26.7％～41.3％,叶绿素a/b比值降低9.3％～11.7％,光合作用增强38.8％～44.6％,除株系TC3的叶绿素a含量、叶绿素总量增加不显著(P＞0.05,下同)外,其余指标均达差异显著水平(P＜0.05),且株高比野生烟草增加7.8％～24.5％,但差异不显著.[结论]AtCAO基因显著增加了弱光下烟草的叶绿素a、b含量,增强了光合作用,且一定程度上促进了烟草植株的生长,推测其可在其他作物的耐弱光性改良上发挥作用.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2015(046)006【总页数】7页(P951-957)【关键词】烟草;AtCAO基因;光合作用;耐弱光性【作者】张伟;李翠萍;张兴国;张煜【作者单位】新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南新乡453003;新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南新乡453003;西南大学园艺园林学院/南方山地园艺学教育部重点实验室,重庆400715;新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】S572张伟1*，李翠萍1*，张兴国2，张煜1（1新乡医学院生物化学与分子生物学教研室，河南新乡453003；2西南大学园艺园林学院/南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆400715）【研究意义】弱光逆境不仅影响植物叶绿素含量，还影响光合速率、光合产物的运输与分配，进而影响植株的生长与发育（Tanaka et al.，2001；Pattanayak etal.，2005）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
诱导
? 当菌摇到 OD6001.0 时，5 000 rpm 10 min 收集菌体，用溶液 (5 ml 10 mM MgCl2 ，7.5 μL 100 mM 乙酰丁香酮 )重悬农杆菌至 OD6001.0 ，室温静置 至少3 h
侵染
? 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约 48 h后，Gus 染色观察
植物基因转化受体
?高效稳定的再生能力 ?较高的遗传稳定性 ?具有稳定的外植体来源 ?对选择性抗生素敏感 ?对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型： ? 愈伤组织再生系统 ? 直接分化再生系统 ? 原生质体再生系统 ? 胚状体再生系统 ? 生殖细胞受体系统
植物遗传转化方法
植物遗传转化
农杆菌介导法
? 收集菌体，重悬于浸染缓冲液 (1/2MS ，5% 蔗糖， 0.015% Silwet L-77) ，将菌液稀释
诱导
至OD600 为0.6-0.8
? 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中， 0.5Mbar 抽
转化
真空10 min
? 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。 1~2 d后去除塑料膜，培养至
诱导
? 5000 rpm 离心5 min 收集菌体，重悬于浸染缓冲液 (1/2MS ，5% 蔗糖， 乙酰丁香酮 120μmol/L) ，将菌液稀释至 OD600 为0.6-0.8
侵染
? 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染 10min 后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（ MS+5% 蔗糖+乙酰丁香 酮120μmol/L ）上（25±2）℃暗培养条件下培养 2d。
注射法瞬时转化烟草
? 种植本生烟 (Nicotianabenthamiana )：25 °C ，16 h 光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
? 小量培养农杆菌 16-24 h ；按1:100 转接到培养液 (5 mL YEP ，100 μ M乙酰 丁香酮(Aldrich) ，10 mM MES(pH 5.6) ，Rif 100 μg/mL ，Kan 50 μg/mL ）
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
? 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
? 接种含有表达载体的农杆菌 GV3101 克隆于5 mL YEP 液体培养基 (Rif 100 μg/mL ，
乙酰丁香酮
Vir 区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir 区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone ，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3 ）AS：
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能 够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir 基因活化，从而促进外 源基因的整合。 使用方法： ?在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir 基因 高度活化状态，从而提高侵染能力 ? 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 ? 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h 后才能进行转 化 ? 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Nicotiana tabacum
Arabidopsis thaliana
选择标记基因与报告基因
必备条件： ? 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 ? 基因较小 ? 能在转化体中得到充分表达 ? 检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因： npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat （链霉素，壮观霉 素），spe（壮观霉素），strl （链霉素），cat （氯霉素），bar （草苷膦） 报告基因：report gene （筛选标记之一） 在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能 在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。 gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因） 转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。
接种
Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200 rpm 振荡培养过夜
? 将过夜培养的菌液按照 1:100 的比例转接到 50 mL 新鲜配制的 YEP 液体培养基 (Rif 100
活化
μg/mL ，Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200rpm 振荡过夜培养至菌液 OD600 为1-2
培养
种子成熟
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
? 接种含有表达载体的农杆菌 GV3101 克隆于5 mL YEP 液体培养基 (Rif 100 μg/mL ，Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200 rpm 振荡培养过夜
活化
? 将过夜培养的菌液按照 1:100的比例转接到 50 mL 新鲜配制的 YEP 液 体培养基 (Rif 100 μg/mL ，Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200 rpm 振荡培 养至菌液 OD600 为1-2
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： ?T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 ? T-DNA 与植物DNA连接处富含A-T 碱基对 ?植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
基因枪法 PEG 诱导原生质
体 电穿孔法
双子叶植物
无宿主限制， 技术限制
原生质体培 养
操作简单，易造 成原生质体损伤
转基因方法
农杆菌侵染法
基因枪法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
? 对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti 质粒和Ri 质粒， 其上有一段T-DNA， 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物 基因组中。