实验四农杆菌转化烟草和拟南芥

注射法瞬时转化烟草
? 种植本生烟 (Nicotianabenthamiana )：25 °C ，16 h 光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
? 小量培养农杆菌 16-24 h ；按1:100 转接到培养液 (5 mL YEP ，100 μ M乙酰 丁香酮(Aldrich) ，10 mM MES(pH 5.6) ，Rif 100 μg/mL ，Kan 50 μg/mL ）
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
? 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
? 接种含有表达载体的农杆菌 GV3101 克隆于5 mL YEP 液体培养基 (Rif 100 μg/mL ，
乙酰丁香酮
Vir 区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir 区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone ，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3 ）AS：
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能 够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir 基因活化，从而促进外 源基因的整合。 使用方法： ?在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir 基因 高度活化状态，从而提高侵染能力 ? 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 ? 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h 后才能进行转 化 ? 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
诱导
? 5000 rpm 离心5 min 收集菌体，重悬于浸染缓冲液 (1/2MS ，5% 蔗糖， 乙酰丁香酮 120μmol/L) ，将菌液稀释至 OD600 为0.6-0.8
侵染
? 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染 10min 后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（ MS+5% 蔗糖+乙酰丁香 酮120μmol/L ）上（25±2）℃暗培养条件下培养 2d。
培养
种子成熟
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
? 接种含有表达载体的农杆菌 GV3101 克隆于5 mL YEP 液体培养基 (Rif 100 μg/mL ，Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200 rpm 振荡培养过夜
活化
? 将过夜培养的菌液按照 1:100的比例转接到 50 mL 新鲜配制的 YEP 液 体培养基 (Rif 100 μg/mL ，Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200 rpm 振荡培 养至菌液 OD600 为1-2
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： ?T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 ? T-DNA 与植物DNA连接处富含A-T 碱基对 ?植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
接种
Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200 rpm 振荡培养过夜
? 将过夜培养的菌液按照 1:100 的比例转接到 50 mL 新鲜配制的 YEP 液体培养基 (Rif 100
活化
μg/mL ，Kan 50 μg/mL) 中，28 °C，200rpm 振荡过夜培养至菌液 OD600 为1-2
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥
Nicotiana tabacum
Arabidopsis thaliana
选择标记基因与报告基因
必备条件： ? 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 ? 基因较小 ? 能在转化体中得到充分表达 ? 检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因： npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat （链霉素，壮观霉 素），spe（壮观霉素），strl （链霉素），cat （氯霉素），bar （草苷膦） 报告基因：report gene （筛选标记之一） 在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能 在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。 gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因） 转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。
接种与活化 中，28 °C16-24 h
诱导
? 当菌摇到 OD6001.0 时，5 000 rpm 10 min 收集菌体，用溶液 (5 ml 10 mM MgCl2 ，7.5 μL 100 mM 乙酰丁香酮 )重悬农杆菌至 OD6001.0 ，室温静置 至少3 h
侵染
? 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约 48 h后，Gus 染色观察
基因枪法 PEG 诱导原生质
体 电穿孔法
双子叶植物
无宿主限制， 技术限制
原生质体培 养
操作简单，易造 成原生质体损伤
转基因方法
农杆菌侵染法
基因枪法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
? 对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti 质粒和Ri 质粒， 其上有一段T-DNA， 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物 基因组中。
植物基因转化受体
?高效稳定的再生能力 ?较高的遗传稳定性 ?具有稳定的外植体来源 ?对选择性抗生素敏感 ?对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型： ? 愈伤组织再生系统 ? 直接分化再生系统 ? 原生质体再生系统 ? 胚状体再生系统 ? 生殖细胞受体系统
植物遗传转化方法
植物遗传转化
农杆菌介导法
? 收集菌体，重悬于浸染缓冲液 (1/2MS ，5% 蔗糖， 0.015% Silwet L-77) ，将菌液稀释
诱导
至OD600 为0.6-0.8
? 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中， 0.5Mbar 抽
转化
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? 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。 1~2 d后去除塑料膜，培养至