《超薄切片技术》PPT课件 (2)

第二节 普通超薄切片技术
一 取材 二 固定 三 脱水 四 渗透与包埋 五 超薄切片 六 电子染色
一、取材
1、含义
指从生物体上取下要观察的组织块。 注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶
2、取材操作规则
操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤)
⑴ 快：动作迅速,快取,投入固定液 ⑵ 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4 ⑶ 冷：0～4℃ ⑷ 准：取的部位准，有代表性、目的性 ⑸ 轻：操作轻巧，避免拉、锯、压
1）组成： 固定液：固定剂＋缓冲液
2）作用： ⑴ 破坏细胞的酶活性系统 ⑵ 稳定细胞物质成分，并保存之 ⑶ 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收 缩或膨胀 ⑷ 在组分的分子之间建立交联，提供骨架 稳定细胞器的空间构型 ⑸ 提供一定的电子反差
（二）常用的固定剂
1、常用、理想固定剂应具备的条件
1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各 部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化 2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变 性，以保证后续的各种处理中物质不溶 解、不丢失 3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产 生人工假象，以保证电镜图像的真实性。 4) 能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定 5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用
⑵ 切片厚度500～700Å为宜 ,小于1000 Å
太薄：高，反差低 太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至
不 能穿透
⑶ 切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华 ⑷ 切片能够适当被染色，保证一定的反差 ⑸ 切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他
化学物质的沉淀
4、超薄切片制备的一般程序：
取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切 片→染色
2、理想固定剂
1优）点锇：酸（OsO4)
⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 ⑵ 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作
用良好
⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物
⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好
锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对 微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 ⑹ 有挥发性、剧毒
3、取材方法 A、按样品类别分为：
⑴动物材料 麻醉→解剖→ 戊二醛预固定（ 0～4℃， 2％～5％） 在预冷的玻板上细切（1mm3） →戊二醛前固定 (1～3h) →漂洗（10～30min） → 1％锇酸后固定 (1～2h)
⑵植物材料 叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡 根茎果实1mm3
⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块
不沉淀
3、附加剂： 调节渗透压，NaCL, CaCL2，蔗 糖，葡萄糖
4、常用缓冲液
⑴．磷酸盐缓冲液
储备A液(0.2M):磷酸氢二钠
(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml 储备B液(0.2M):磷酸二氢钠
(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml
pH（25。 6.2 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6
缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染
⑵．巴比妥盐
对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存
⑶．二钾胂酸盐
可长期保存，有毒，有臭味
（四）、固定
1、固定液的配制
2、固定的方法 1）按固定液的成分划分为：
⑴单固定： 戊二醛或锇酸单次固定1～3小时
⑵双固定： 前固定（戊），漂洗，后固定（锇）
⑶多重固定：
用三种以上的固定剂对样品进行固定
3) pH值：植物6.8～7.1,动7.2～7.4 4) 固定的温度：0～4℃
但低温对细胞微丝、微管有害 5) 组织块的大小：0.5～1mm3 6) 固定液的用量，一般为组织块的500倍
三 脱水(dehydrate)
1. 定义： 用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的
游离态水分的过程。
2. 脱水的原因：
2）戊二醛（ C5H8O2） 优点：
⑴ 固定迅速，样品块可以大于1mm3 ⑵ 能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微
管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较 强的亲和力 ⑶ 可长时间固定（<7天），适于野外取材 ⑷ 不易使酶失活，适于细胞化学研究 ⑸ 不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有 刺激性
B、按取材地点分为：
⑴野外取材：冰壶 ⑵实验室室内取材
二、固定
（一）固定的基本知识
1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系 到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的 保存下来.
2、常用的固定方法 化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛 （C5H8O2), 甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛 物理方法：冷冻，干燥，高温
C）
A液 9.25 18.7 24. 30.5 36.0 40.5 43.5
5
5
B液 40.7 31.2 25. 19.5 14.0 9.5 6.5
5
5
5
0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液
(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。
优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置
优点：分子量小，粘度低,易渗透；,硬度易 调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差 好；无毒性，便宜
缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变 化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击 易升华或蒸发
2) 聚酯树脂
优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚 合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，
缺点：不稳定，易脆裂
3) 甲醛（HCHO） ：甲醛＋戊二醛
滲透速度快、固定迅速，对酶活 性的保护优于 戊二醛，经济方便
4) 高锰酸钾（KMnO4)
磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结 构、叶绿素固定良好。
（三）缓冲液和附加剂
1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分， 对细胞富有生理保护功能的溶液
2、缓冲液主要作用
⑴ 维持稳定的pH值 ⑵ 提供适当的渗透压 ⑶ 提供适当的离子成分使样品不抽提，
2）按固定方式分为：
a. 浸泡固定 b. 体外固定
c. 原位固定 d. 灌流固定
固定操作示意图
漂洗操作方法
3、固定注意事项：
1) 固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3% 浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀 浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋 白质分子氧化而断裂
2) 固定液的渗透压： 渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀 渗透压高→细胞收缩
⑴ 聚合有良好的切割性能，软硬度易调节 ⑵ 粘度低,易渗透 ⑶ 溶于脱水剂 ⑷ 电子透明度好,并具有一定的反差 ⑸ 聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低 ⑹ 本身无结构 ⑺ 热稳定性好,可耐电子束轰击 ⑻ 来源丰富，且各批号性能尽可能一致 ⑼ 切片易染色,且对人体无害
2、常用包埋剂
1) 甲基丙烯酸酯
3）水溶性包埋剂
常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇
(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA) 注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需
紫外照射
应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究
4) 环氧树脂类包埋剂：
特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰
击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用
植物材料
1 1～12 2～12
体外培养细胞
0.5 0.5~1
0.5
（二）、包埋(embedding)
包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经 加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱 其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。
1、包埋剂应具备的条件:
4. 常用的脱水剂： 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、 环氧丙烷、包埋剂的单体。
5. 脱水注意事项: ⑴ 脱水要彻底 ⑵ 更换液体动作要迅速 ⑶ 脱水时间不宜过长 ⑷ 固定后的 样品要充分漂洗
附加步骤：块染（Block Staining)
块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后 的染色可称为“片染”）
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常用试剂：Epon-812 ,国产618，ERL－4206
Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透
加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨
基甲基苯酚）
固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软
MNA（六甲酸酐）
，块硬
3. 常用配方：
⑴ Epon-812配方（1961，Luft)
A液： Epon－812 5ml
石
蜡切片h=10m(5~50m) 超薄切片TEM专用，一
般500～700Å
2、制作超薄切片的必要性
1). 增加电子透射能力 2). 电镜的场深大，切片太厚，上下结构重
叠,使得图像不清楚 3). 减少色差 4). 减少样品对电子的吸收
3、对超薄切片的要求
⑴ 细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、 丢失、添加等人工效应
⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样 品，提高包埋质量必须对样品脱水；
⑵湿样品反差低、必须干 燥； ⑶含水样品在高真空下容易被破坏。
3. 脱水的原则：逐级梯度脱水(80%及以前4℃)
30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5 ~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％环 氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min)
（一）、渗透（Infiltrate)
渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱 水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙 被渗透液填充。
脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂 脱水剂:包埋剂＝3:1 → 1:1 → 1:3
→纯包埋剂
渗透时间表(小时）
脱水剂：包埋剂
3：1 1：1 1：3
动物材料
1 1～4 1～2
DDSA
8ml
B液： Epon－812 5ml
MNA
7ml
最终： A液13， B液15，
DMP-30 16滴（1~2%）
夏天：A：B=2：8（A多软）
脱水前染色： 双固定→ 漂洗→ 0.5％~4%的醋酸双氧铀染色，1h,4℃→脱水
脱水时染色： 脱水至70％乙醇→ 硝酸铅的70％乙醇饱和溶液中2h,4℃→ 70％乙醇漂洗→ 继续 脱水
四 渗透与包埋
目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与 细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质 的超薄切片。
步骤：渗透，包埋，聚合
第四章 超薄切片技术
第一节 基本概念
一、生物样品制备技术的重要性 二、TEM样品制备技术分类 三、扫描电镜样品制备技术 四、超薄切片技术概述
一、生物样品制备技术的重要性
1、决定电镜图像分辨率的两个因素
1）电镜本身的分辨本领
2）
样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很 大
程度又取决于样品制备技术
2、电镜样品应具备的基本条件
戊二醛缺点： ⑴ 不保存脂肪 ⑵ 无电子染色作用 ⑶ 对缓冲液的要求严格
四氧化锇与戊二醛的固定作用比较
固定剂 蛋白质 核蛋白 戊二醛 尚好 很好 锇酸 好 很好
脂类 很差 良好
糖元 很好 很差
固定剂 核酸 渗透 电子染色 对 BS的选择性 戊二醛 较好 大 无 强 锇酸 很差 小 有 不强
双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这 种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。
1）样品必须彻底干燥； 2）样品要进行提高反差处理 3）样品厚度要适宜 4）样品耐受电子束的轰击
5）充分保存好生物样品的超微结构
二、TEM样品制备技术分类
1、超薄切片技术（普通） 2、冷冻超薄切片技术 3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术 5、表面复型技术 6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术 7、免疫电镜技术 8、电镜细胞化学技术 TEM，SEM共有 9、电镜放射自显影技术
三、扫描电镜样品制备技术
1、表面镀金（喷镀）技术 2、组织导电技术 3、冷冻断裂技术 4、离子蚀刻技术 5、临界点干燥技术 6、冷冻干燥技术 7、铸型观察技术（复型） SEM,TEM共有
注： 最基本、最经典的还是超薄切片技术
四、超薄切片技术概述
1、超薄切片
★样品厚度在10～100nm之间的切片为～
3、固定的目的
⑴ 把细胞中的动态系统定格，要求生命过 程立即停止,细胞和它周围组织中的半液 体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有 机体的生活状态
⑵ 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 ⑶ 使其在电镜下有良好的电子反差
4、固定的标准
细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡 和颗粒凝集
5、固定液的作用