第二章： 愈伤组织培养

一）、 愈伤组织形成
1 、器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由大小不等的细
胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定 状态。
在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成 分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起 源。
根发生在组织的深处，与整体植株发生类似， 是内起源。
愈伤组织的外部形态也随分化而改变，一般 由疏松转向紧密。
• 无论在MS还是在H或B5培养基中，不附加激素2, 4-D均不能诱导 扁桃花药愈伤组织的形成，
• 扁桃花药在H+1.0mg/L 2,4-D的培养基上诱导率最高为47%;在 MS+1.0mg/L 2,4-D培养基上诱导率为67.0%;在B5+0.5～ 1.0mg/L2,4-D，出愈率都在84.0%以上，其中以2,4-D为0.5mg/L时， 出愈率高达100%.。说明在扁桃花药诱导过程中，最适基本培养 基是B5，最佳 2,4-D浓度为0.5mg/L。
分裂期：
外植体(explant)中已分 化的活细胞在外源激素的作 用下，外植体外层细胞出现 了分裂，由于外层细胞的迅 速分裂使得这些细胞的体积 缩小，逐渐回复到分生组织 状态，该时期细胞通过脱分 化的起动期而进入分裂，并 开始形成愈伤组织。
分裂期特征：
生理生化上分裂期的一个明显特征 是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不 分裂。另外还有细胞数目增加，体积变 小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量 达到最高等。
• 此时期的愈伤组织：细胞分裂快， 结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅 而透明。
分裂期愈伤组织
形成期：
• 细胞分裂从分裂期的周缘细胞分 裂为主逐渐转向内部的组织细胞， 愈伤组织表层细胞分裂减缓或停 止，内部深层细胞分裂并形成像 维管束或类似于分生组织组成的 鸟巢状结构的次生组织。
• 此时期中细胞的伸展和分裂处于 平衡，故细胞的平均大小趋于稳 定。
* 表中数据取材于杨宁等人的《当归愈伤组织的增殖与分化培养》
三、愈伤组织的形态发生
• 愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分 化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体， 继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整 小植株。
• 愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式 主要有三种：1)、先产生芽，后在茎的基部长 根；2)先长根，再长芽；3)愈伤组织的不同部位 分别形成根和芽。
• 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同基 因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时， 培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素 （KT）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分 化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差 异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植 株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的 取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段,当下胚 轴长到2~3cm时取材最佳（见表3-6）
芦荟愈伤组织形态发生的人为调控
1、先用MS培养附加不同浓度的6BA，促进不定 芽的生成。
不同浓度6-BA对库拉索芦荟增殖的影响
芦荟愈伤组织形态发生的人为调控
2、然后将抽枝的小植株转移到MS附加不同浓度 NAA培养基上培养，诱导根的发生与生长 。
不同浓度NAA对库拉索芦荟生根的影响
影响愈伤组织分化的其他因素
第二章： 愈伤组织培养
主讲教师： 联系方式：
蔡建秀
主要内容:
• 基本概念 • 愈伤组织的诱导与分化 • 愈伤组织的形态发生 • 愈伤组织的培养
一、基本概念
• 脱分化 ： 具有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，
细胞改变原来的分化状态，失去原有的结构与功能， 转变为具有分生能力的细胞的过程 。
影响愈伤组织分化的其他因素
物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈
淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色或红色。
•
一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有
的色素大致相同， 但经过反复继代培养后会失去
色素。
植物愈伤组织类型举例：
根尖愈伤组织 （无色透明）
茎尖愈伤组织 （淡绿色）
锁阳愈伤组织（红色） 香茶菜愈伤组织
当归茎段愈伤组织（绿色）
杨宁[2]等人用MS培养基作为基本培养继进行当归愈伤组织增 殖培养的研究表明，单独使用一种生长素时，愈伤组织增殖很不 明显；若只使用一种细胞分裂素时，愈伤组织均不见增殖，并且 生长状况也不佳；但将二者合理搭配使用时，愈伤组织不仅增殖 较明显，而且生长状况较佳。可见，兼用生长素和6-BA增效作用 较明显
在外源植物激素的作用下，处于静止状态的植物细胞经过复 杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞。此过程有人称之 为：细胞的诱导活化过程。
有人认为损伤是诱导细胞分裂的重要因素。受伤细胞释放出 的物质与外ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ激素共同诱导细胞发生分裂，是诱导植物愈伤组织 形成的主要原因。
Brown（1972）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存 在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去 抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源 物质（激素），细胞就立即进行DNA复制，全部细胞进入S期， 并发生同步分裂。
特点：
• 在诱导期，代谢活化了，细胞内的合 成代谢迅速进行，但是细胞的大小仍 然和外植体时一样，没有多大改变。
处于起始 期外植体
诱导期的长短
• 由一系列内部（植物的种类、生理状况） 和外部（光照、外源激素）因素决定。 例如：菊芋的诱导期有时还不需要1天， 胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时 间的改变，诱导期也发生改变。从11月 到次年4月取菊芋块茎进行培养，则诱导 期从22小时逐渐延长到40小时。
不同基因型、激素浓度对大豆植株再生的影响
木本植物愈伤组织形态发生的人为调控
• 第一步：利用分化培养基（含有6BA、CPPU、KT）使愈伤组织形成不定 芽，增加繁殖系数。
• 第二步：当不定芽长大出现叶片后， 再将伸长的苗从基部切下转入含生长素 类（如IAA、NAA）的生根培养基上培 养诱导根的生成。
杨宁[1]等人的研究表明， 植物扁桃（‘Naporeil’ 品种）的茎段、花药在适宜的培养基上能比较容易的诱 导出愈伤组织， 而叶肉组织则不能或难以诱导形成愈 伤组织。
影响植物愈伤组织形成的因素：
2、选择适宜基本培养基不仅影响愈伤组织的诱导，而且影响伤组 织的生长。
于树宏和李玲（1999）用浅绿色野葛叶片愈伤组织进行继代 培养，用MS+1mg/L NAA， 愈伤组织呈浅绿色，新鲜健壮；在 培养基中同时加入3mg/L 6-BA 和1mg/L NAA,愈伤组织生长迅速， 若培养时间较长，形成的愈伤组织呈白、硬颗粒状， 部分会发生 褐变死亡；但若将愈伤组织置于含相同浓度6-BA和NAA的 B5 培 养基上生长，愈伤组织可以始终保持新鲜健壮的外观， 而且不断 生长。
案例1：MS培养基含有不同浓度2，4-D时斑茅幼叶形成愈伤组织的诱导率（%）
不同浓度的2，4-D对愈伤组织的诱导率是不同的。一般情况下，2，4-D的 浓度过低（低于10-9mg/L）时，愈伤组织生长缓慢；浓度过高（高于10 mg/L） 时，就会抑制愈伤组织的生长。
• 案例2. 不同培养基及激素浓度对诱导扁桃花药愈伤组织的影响
条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。
1、 常用激素与浓度
激素类型
激素浓度
生长素类（2，4-D,
0.01~10 mg/L
IAA , NAA)
细胞分裂素类（玉米素， 0.1~10 mg /L
6-BA )
2、影响愈伤组织诱导的因素：
• 1）、激素： 多数情况下，单独使用2，4-D可以成功诱导愈伤组织的发生
影响植物愈伤组织形成的因素：
1、 同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同。例如： 君子兰 用MS+2mg/L 6-BA +2mg/L NAA +1mg/L 2,4-D 固体培养基培养，茎尖、茎切块和叶片形成愈伤组织的 诱导率分别为85%、13%和72%；若用MS+5mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA +1mg/L 2,4-D 固体培养基培养,三种外植 体形成愈伤组织的诱导率分别为82% 、9%和70%。这 说明培养基中植物生长物质组成的比例不同，直接影响 着愈伤组织的形成。
• 愈伤组织： 植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经脱
分化等一系列过程，转变为分生细胞，进而转变形成 一种能够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团
一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤 组织的潜在可能性。
自然条件下的植物愈伤组织
刺桐树
二、愈伤组织的诱导与分化
一）、愈伤组织的诱导
诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养
形成期愈伤组织的特点：
• 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色， 有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织 多转变为黄色甚至褐色。
提醒：
根据形态变化列出三个时期，实际上 它们的界限并不分严格，特别是分裂期 和分化期。一块培养组织的细胞既有分 裂的又有分化的。
愈伤组织的类型：
•
不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和
2、体细胞胚的发生
• 愈伤组织 体细胞胚 植株
二）、激素对愈伤组织分化的影响
• 植物生长调节物质在分化过程中的 作用是极为明显的，合适的植物生长物 质配比在器官分化中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中， 当6-BA的浓度是NAA的50~100倍时，茎 段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔 球形成。
研究表明：
• 生长素与细胞分裂素对保持愈伤组织的 快速生长是必要的，特别是二者搭配使 用时更能强烈刺激愈伤组织的形成。
• 在愈伤组织的诱导时，植物材料不同所 用的植物生长调节物质不同，使用的浓 度也不同。
2）.培养基
不同的培养基成分对植物不同器官的愈伤 组织诱导存在着影响