第六章 沉淀法和吸附法

3、有机溶剂沉淀实例
（四）生成盐复合物沉淀——柠檬酸钙盐沉淀
1、提取过程的化学反应： 2C6H8O7•H2O+3CaCO3 →Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3CO2↑+H2O Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3H2SO4+ 4H2O
→ 2C6H8O7•H2O+3CaSO4 •2H2O
1、工艺流程：
吸附作用力也是范德华力。它是一组分子引力 的总称，包括三种力，即定向力、诱导力和色散力。 定向力：是极性分子之间产生的作用力，是极性分子间
的静电引力，分子的极性越大，力也越大。
诱导力：指极性分子和非极性分子之间的吸引力，极性 分子产生的电场作用会诱导非极性分子极化， 两者之间相互吸引而发生吸附作用。这种力与 温度无关。
优点：
许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许。
缺点：
酸化时，容易引起蛋白质失活，因为蛋白质 对低pH比较敏感。
等电点沉淀实例
从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI ＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除
去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产
胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋
有机溶剂的种类：选择的溶剂必须能与水互溶，
但与产物如蛋白质等不发生反应。
温度：降低温度可以增加收率。同时许多生物分 子如蛋白质、核酸等对温度特别敏感，温度稍有
升高，便发生变性。
pH：选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀 效果。因此在接近等电点处，以引起沉淀所需有 机溶剂的量较少。合适的pH也可大大提高分离的 分辨能力。
第六章 沉淀法和吸附法
一、沉淀法
二、吸附法
一、沉淀法
(一)盐析法 (二)有机溶剂沉淀法 (三)等电点沉淀法 (四)生成盐复合物沉淀法
一、 沉 淀 法
沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液
中的溶质由液相转变为固相析出的过程。
优点：
成本低 设备简单
收率高蛋白质和酶。
离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即
得较纯的碱性磷酸酯酶。
(三)有机溶剂沉淀法
1、有机溶剂沉淀的原理
许多水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等 能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、 蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。其主要作用 是降低水溶液的介电常数。
有机溶剂沉淀原理图
优点：
分辨能力比盐析法高 一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀 沉淀不需脱盐
度随温度的升高反而减小。
pH对β的影响
盐析pH的选择要以不
降低产物的活性为原则。
由于蛋白质在等电点时 最易沉淀，可选择等电 点的pH作为盐析的pH
二次盐析
(二)等电点沉淀法
是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的
原理，进行物质分离纯化的方法。
中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值
向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。
logS＝β- Ks•Ⅰ
S—离子强度为Ⅰ时的蛋白质的溶解度；
Ks—盐析常数，与温度和pH无关；
β值—是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不 同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pH值有关，但与盐的种 类无关;为便于计算，用盐的摩尔数m代替离子强度I，则 logS＝β-Ks• m
盐析机理示意图
白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入
一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
等电点沉淀实例
碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0 后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉
淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重
新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，
控制终点；
过滤：过滤槽、带式过滤机， 90℃热水逆流洗涤， 至pH大于4。
二、吸附法
(一)吸附过程的基础理论 (二)吸附类型 (三)影响吸附过程的因素
(一)吸附过程的基础理论
选择性吸附法用于：分离精制各种产品、空气的
净化、除菌、脱色、除热源、去组胺等杂质。
吸附作用：物质从流体相(气体或液体)浓缩到固体表面 的过程。 吸附剂：在表面上能够发生吸附作用的固体。 吸附物：被吸附的物质。 不同固体物质的表面自由能不同，所以对其他物质 的吸附能力不同，表面自由能越高，吸附能力越强。
（三） 影响吸附的因素
溶液中，固体吸附剂的吸附要考虑三种作用力： 界面层上固体与溶质之间的作用力； 固体与溶剂之间的作用力； 溶质与溶液之间的作用力。
影响吸附的因素：
吸附剂的性质：容量大、速度快、机械强度高 吸附物的性质：极性宜从非极性中吸附极性物 溶液pH的影响：非极性宜从酸性中吸附有机酸 温度的影响：吸附热越大，受温度影响越大 溶液中其他溶质的影响：一般使吸附量下降
2、化学吸附
吸附剂与吸附物之间由于电子转移发生化学反应产生的吸附。
特点：
需要一定的活化能； 具有显著的选择性，一种吸附剂只对特定的物质有吸附作用；


吸附速度较慢，升高温度速度增加；
吸附后也较稳定，不易解吸，且解吸具有选择性； 吸附热较大。
物理吸附与化学吸附虽有区别，但有时很难
严格划分，也可以在同一体系中向时发生。
盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解
蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破
坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；
盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分
子的极化，使水活度降低。
碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图 pH6.6，温度25℃，logS0=17g· L-1
样品浓度和分子质量：低浓度样品需用有机溶剂 的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效
果；但低浓度样品损失较大，回收率低，具有生
理活性的样品容易产生稀释变性。 金属离子和离子强度：Mn2+、Fe2+、Co2+、Zn2+等 阳离子能与蛋白质中的羧基、氨基和含有氮杂环 的化合物结合，形成难溶复合物，有利于沉淀。 但离子强度过大，不利分离。
②有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等
产品的分离纯化，也有用于蛋白质的沉淀。
③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质
的沉淀。 ④生成盐复合物沉淀法：用于多种化合物，特别是小分 子物质的沉淀。
(一)盐析法
1、盐析原理
高浓度的中性盐能破坏蛋白质、酶等的胶体性质，
中和微粒上的电荷，促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象。
不同蛋白质的溶解度曲线
蛋白质的盐析分布曲线
溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b)
2、影响盐析的主要因素 蛋白质起始浓度的影响
高浓度蛋白质溶液可以 减少盐的用量，但蛋白
质浓度太高，会发生严
重的共沉作用。
无机盐种类的影响
离子强度越大，蛋白质
的溶解度越低。不同蛋
白质盐析所需离子强度 不同。可用不同的盐浓 度将各种蛋白质分别沉 淀析出。
等电点沉淀法应在低离子强度下操作。
许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。
(二)等电点沉淀法
是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的 原理进行物质分离纯化的方法。 中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值
向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。
等电点沉淀法应在低离子强度下操作。
许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。
不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▢)NH4SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠
温度的影响
升温，可增加许多无机盐 和小分子有机物的溶解度。 但在高盐浓度中，蛋白质
等生物大分子物质的溶解
3、中和与酸解
中和：滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残
糖以及蛋白质、金属离子等杂质。利用 柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离
的过程。
酸解：中和所得钙盐经过滤、洗涤，与硫酸反
应生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，过滤，滤
液含较纯的柠檬酸。
4、生产设备及操作
调浆：调浆罐，30—50%浓度；
中和：中和罐，滤液、钙浆泵入，搅拌， 70-90℃ ，控制 终点； 过滤：过滤槽、带式过滤机， 90℃热水逆流洗涤； 酸解：酸解罐，搅拌，稀酸调浆，加热，加硫酸，
作 业
1、何谓盐析？其原理是什么？
2、影响盐析的主要因素有哪些？ 3、有机溶剂沉析法的原理是什么影响有机溶剂沉析的 主要因素有哪些？有机溶剂沉淀的机理 4、吸附的类型有哪些？其各自机理分别是什么？
有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，
容易进行固液分离
有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，
因此适用于食品、药品的制备。
缺点：
容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高
需冷却、降温、低温操作。
对同一种溶剂，蛋白质的分子质量越大， 沉淀所需有机溶剂的量越少。
2、影响有机溶剂沉淀的因素
(二)吸附类型
1、物理吸附：
吸附剂和吸附物通过分子间的引力产生的吸附。 特点： 吸附作用不仅局限于活性中心，而是整个自由界面； 分子被吸附后，一般动能降低，所以吸附是放热反应；
物理吸附的吸附热较小，吸附物分子的状态变化不大，
所需活化能很小，多数在较低的温度下进行； 物理吸附是可逆的，吸附作用一般没有选择性。
色散力：是非极性分子之间的引力，当分子外围电子运动
及原子核在零点附近震动，正负电荷中心出现瞬
时相对位移时，产生快速变化的瞬时偶极矩，能
使外围非极性分子极化，反过来又影响瞬时偶极 矩的变化而产生这种色散力。与温度无关。 此外，还有氢键力，这是介于库仑引力和范德华力之间 的定向力，比诱导力和色散力都大。