第七章 微生物的研究方法

二、染色观察
活菌 压滴
悬滴 美兰染色
方法
正染 单染色法 不能鉴别 复染色法 可鉴别 革染、抗酸性染色 负染 荚膜
其它
二、测大小
测微尺 目镜测微尺 镜台测微尺 步聚：装入目镜
台测微尺夹于载物台 调好光线、焦距、晴晰看到刻度
移到台微尺、转目微尺，使两者刻度第一 条线重合，向
左找出另外重合线 记录两尺重叠格数，公式计算
湿热 物理法
高压 121 ℃ 15-30min 适用范围最广
紫外线和射线 15 w紫外灯 过滤 消毒剂 75 %乙醇、甲醛、乳酸、石炭酸、石灰 水、
化学法 防腐剂
福尔马林、新洁尔灭、龙胆紫等
有机汞、有机锡、酚类等
干燥热空气灭菌注意事项 (1) 灭菌的玻璃器皿切不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌 中容易炸裂。 (2) 灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。 (3) 灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包装纸或棉 花被烤焦。 (4) 灭菌温度恒定在160～170℃为宜。温度超过180℃，棉花、 报纸会烧焦甚至燃烧。
菌落形态 配制培养基 灭菌 纯种分离 鉴定
菌体形态 生理生化实验 菌种保藏、复壮
第一节 配制培养基和纯种分离
一、培养基 按照培养基制成的形式，可分为 （1）液体培养基：增殖、鉴定微生物 （2）固体培养基两种：分离、保藏菌种及鉴定微生物 a 平板培养基：分离、鉴定微生物 b 斜面培养基：培养、保藏菌种 另：常用的凝固剂是琼脂(洋菜)，当加入1.5％－3％时 就形成固体，而加入0.5％－0.8％时，则成半固体。
第三节 保藏与复壮
• 目的 不致死亡、绝种、不污染杂菌、保优 良性状 • 原理 代谢处于不活跃、生长繁殖受抑制
低温 干燥
缺氧
一、保藏 斜面 矿物油 纯种制曲 砂土 适于芽孢、孢子 冷冻干燥
二、菌种的衰退与复壮 1、菌种衰退的原因（1）变异（2）自然“衰老” 2、复壮措施： 改变培养基成分 单个分离 放原环境，再次筛选
表面 边缘 隆起 颜色 光滑、皱褶、粗糙、同心环龟裂 整齐、波状、齿状、卷毛状、轮纹状、木耳状、缺刻状 扁平、略高、微凹、半球、瘤状 突起多丘陵状
光泽 闪光、不闪光、金属光泽
透明 质地 不透明、半透明、透明 油脂、膜、粘稠状、脆
形状 圆形、放射状、假根状、丝状伸展蔓延、分枝状
一、菌体形态（镜检） 1、工具 显微镜 普通光学显微镜：明视野、暗视野、相差、荧光 电子显微镜：几十万倍至一百万倍 扫描电镜 透射电镜
百度文库
培养、分离微生物常用的培养基
二、纯种分离 工具 接种针、接种环、接种钩、玻璃涂棒、移液枪 方法 平板涂布法 倾注平板法 平板划线法
第二节 灭菌
一、概念 消毒：指只杀死一部分微生物，主要是病原微生物 灭菌：指杀死一切微生物，包括芽孢和孢子
二、方法
热灭菌
灼烧
干热
烘烤 常压
160℃ 2h/ 170℃ 1.5h 巴氏消毒 间歇灭菌
(5) 降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物 品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
(6) 培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。
湿热灭菌注意事项 (1) 每次使用前，应检查灭菌锅内有足够水量，使水位过电热管。 (3) 摆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出气孔，必须留出空位 保证其畅通放汽。 (4) 每次开锅前，一定要检查确认锅内无压力！压力指示表必须 指示为0！ (5) 如果使用仪器的过程中发现有超温及超压等异常现象，请断 开电源，开关处于OFF位置，并将插头从电源处拔下，待机器压 力降下来为零时，再打开锅盖进行检查。 (6) 灭菌液体时，应将液体灌装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过 3/4 体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。 (7) 使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100℃后， 开始计算灭菌时间
三、无菌操作
在微生物实验室中所采取的预防杂菌污染的一切操作 措施，主要包括创造无菌环境、使用无菌器材和遵循无 菌操作规范。 无菌环境：酒精灯、超净工作台、无菌室 无菌器材： 无菌操作规范：
第三节 微生物的观察 一、菌落形态
大小 极小（＜1mm）;小（1-2mm）；中等（2-4mm）；大（4mm）
在相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好的原因：
①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助 于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键， 更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比； ②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物； ③蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量， 故可迅速提高灭菌物体的温度。