细胞免疫检测技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
➢特异性抗原皮肤试验 ➢PHA皮肤试验
二、B细胞功能检测
➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
(一)B细胞增殖能力的试验
抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA
B细胞增殖
形态学
3H－TdR掺入 法
(二) 溶血空斑试验
1. 原理：
(三)
1.原理：
B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法
（2）3H-TdR掺入法
试验孔A 均值
SI
570nm
对照孔A 均值
570nm
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强， 重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射 性核素污染问题。
(二) T细胞分泌功能测定
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分 泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子 生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或 基因表达水平，以反映T细胞功能。
一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术
一、中性粒细胞功能的检测
➢ 细胞趋化功能的检测 ➢ 吞噬和杀菌功能的检测
(一) 细胞运动功能——趋化功能检测
滤膜渗透法（Boyden 小室法）
琼脂糖平板法
(二)吞噬和杀菌功能测定
1．显微镜检查法：
吞噬率(%) 吞噬细菌的白细胞数 100 计数的白细胞数
三、NK细胞活性测定
染色计数
➢形态法 ➢酶释法 ➢荧光法 ➢同位素法 ➢化学发光法
离心取上清
靶 测LDH或AKP
细
胞 溶 解
离心取沉淀 测活细胞荧光Baidu Nhomakorabea
测CPM值
常用靶细胞: K562细胞株
测发光强度
第三节 吞噬细胞功能检测技术
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭 作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。
第四节 免疫细胞功能检测的临床应用
反映机体免疫功能状态。 肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于 排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。
2．应用与方法学评价：
➢该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗 体分泌量。 ➢优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检 测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
(四) 体内试验
➢体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风 类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 ➢将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免 疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检 者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞 的功能。
（三）T细胞介导的细胞毒试验
1.原理：
靶细胞抗原
T细胞 靶细胞
致敏CTL
观察杀伤活力
2.方法
➢ 形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 ➢ 同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞
肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定γ射线
意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力
(四) 体内试验
第二节 淋巴细胞的功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。 体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原 或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴 细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞 毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定
淋巴细胞
➢T细胞（负责细胞免疫功能） ➢B细胞（执行体液免疫功能） ➢NK和K细胞（非特异性免疫作用）
用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对125IUdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤 活性。
(五) 巨噬细胞促凝血活性测定
激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活 性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经 37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经 粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即 时记录血浆凝固时间。
12～16
核大小、染色质
增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞
(二)吞噬功能检测
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功 能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细 胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细 胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。
(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定
1．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法 2．非特异性酯酶的测定 常用α-萘醋酸法
(四) 细胞毒作用测定
特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原
3. 检测方法
形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）
DNA合成期 + 3HTdR掺入
母细胞化
收集细胞
检测β射线
测定细胞内的3H－TdR
（1）形态学检查法
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
方法学评价： ➢优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果， 适于基层实验室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影 响，重复性和准确性较差。
杀菌率(%)
胞内含着染菌体的细胞 计数的白细胞数
数
100
2. 溶菌法 杀菌率(%) （1 作用30、60或90 min 菌落数 ）100
0 min 菌落数
3．NBT还原试验
二、巨噬细胞功能检测
(一)炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒， 脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定 量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反 复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中 炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
一、T细胞功能的检测
➢T细胞增殖试验 ➢T细胞分泌功能测定 ➢T细胞介导的细胞毒试验 ➢体内试验
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞
刺激物
DNA合成 母细胞
分化
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
细胞大小(直径μm) 12～20
二、B细胞功能检测
➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
(一)B细胞增殖能力的试验
抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA
B细胞增殖
形态学
3H－TdR掺入 法
(二) 溶血空斑试验
1. 原理：
(三)
1.原理：
B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法
（2）3H-TdR掺入法
试验孔A 均值
SI
570nm
对照孔A 均值
570nm
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强， 重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射 性核素污染问题。
(二) T细胞分泌功能测定
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分 泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子 生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或 基因表达水平，以反映T细胞功能。
一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术
一、中性粒细胞功能的检测
➢ 细胞趋化功能的检测 ➢ 吞噬和杀菌功能的检测
(一) 细胞运动功能——趋化功能检测
滤膜渗透法（Boyden 小室法）
琼脂糖平板法
(二)吞噬和杀菌功能测定
1．显微镜检查法：
吞噬率(%) 吞噬细菌的白细胞数 100 计数的白细胞数
三、NK细胞活性测定
染色计数
➢形态法 ➢酶释法 ➢荧光法 ➢同位素法 ➢化学发光法
离心取上清
靶 测LDH或AKP
细
胞 溶 解
离心取沉淀 测活细胞荧光Baidu Nhomakorabea
测CPM值
常用靶细胞: K562细胞株
测发光强度
第三节 吞噬细胞功能检测技术
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭 作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。
第四节 免疫细胞功能检测的临床应用
反映机体免疫功能状态。 肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于 排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。
2．应用与方法学评价：
➢该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗 体分泌量。 ➢优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检 测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
(四) 体内试验
➢体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风 类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 ➢将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免 疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检 者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞 的功能。
（三）T细胞介导的细胞毒试验
1.原理：
靶细胞抗原
T细胞 靶细胞
致敏CTL
观察杀伤活力
2.方法
➢ 形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 ➢ 同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞
肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定γ射线
意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力
(四) 体内试验
第二节 淋巴细胞的功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。 体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原 或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴 细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞 毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定
淋巴细胞
➢T细胞（负责细胞免疫功能） ➢B细胞（执行体液免疫功能） ➢NK和K细胞（非特异性免疫作用）
用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对125IUdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤 活性。
(五) 巨噬细胞促凝血活性测定
激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活 性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经 37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经 粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即 时记录血浆凝固时间。
12～16
核大小、染色质
增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞
(二)吞噬功能检测
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功 能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细 胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细 胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。
(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定
1．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法 2．非特异性酯酶的测定 常用α-萘醋酸法
(四) 细胞毒作用测定
特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原
3. 检测方法
形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）
DNA合成期 + 3HTdR掺入
母细胞化
收集细胞
检测β射线
测定细胞内的3H－TdR
（1）形态学检查法
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
方法学评价： ➢优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果， 适于基层实验室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影 响，重复性和准确性较差。
杀菌率(%)
胞内含着染菌体的细胞 计数的白细胞数
数
100
2. 溶菌法 杀菌率(%) （1 作用30、60或90 min 菌落数 ）100
0 min 菌落数
3．NBT还原试验
二、巨噬细胞功能检测
(一)炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒， 脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定 量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反 复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中 炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
一、T细胞功能的检测
➢T细胞增殖试验 ➢T细胞分泌功能测定 ➢T细胞介导的细胞毒试验 ➢体内试验
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞
刺激物
DNA合成 母细胞
分化
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
细胞大小(直径μm) 12～20