革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程及原理

一，过程

1 ．涂片

将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2 ．染色

( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。

( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。

( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

二，原理

革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保

留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

青霉素作用机制

干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。

溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用

溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏

多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的

N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的

B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分

解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流

出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷

的病毒蛋白直接结合，与DNA，RNA，脱

辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此该酶

具有抗菌消炎，抗病毒等作用

判断细菌有无鞭毛的方法

电镜观察，鞭毛染色，半固体穿刺培养，菌落形态观察

描述细菌与古细菌在细胞膜上的主要化学区别

在革兰氏阴性菌的表层，有由肽葡聚糖形成的细胞壁，在壁的外面，又有由蛋白质、磷脂质、脂多糖形成的膜层，与里面的细胞质膜相对应，特称此层为细菌外膜。外膜比细胞质膜的磷脂质含量低，但脂多糖的含量则比较高。外膜的蛋白质与细胞质膜不同，主要部分为数种蛋白质所构成。其主要蛋白质的部分与特异的内面的肽葡聚糖以共价键结合。脂多糖存在于外膜的最外层。在外膜中仅知有磷脂酶，在细胞与外界的联系中，已看到有许多功能的蛋白质，即有各种噬菌体、维生素B12、大肠杆菌素等的受体存在，而其一部分蛋白质则与DNA的复制、细胞分裂有关，此外，外膜对水溶性低分子物质容易透过，但对抗菌物质则是透过的屏障，它对革兰氏阴性菌间的透过性带来很大的差异。

对于古细菌来说，细胞壁不含肽聚糖，有的以蛋白质为主，有的含杂多糖，有的类似于肽聚糖，但都不含胞壁酸、D型氨基酸和二氨基庚二酸。

缺乏细胞壁的原核生物，除了自然界天然存在的缺壁细胞，比如支原体外，实验室菌种的突变、人为抑制新细胞壁合成、和对现成细胞壁进行酶解都可以得到缺壁细胞。

缺壁细胞主要有四类：Ｌ型细菌，原生质体，球状体，以及支原体。

Ｌ型细菌；

形成；实验室或宿主体内通过自发性突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷菌株

特点；细胞膨大，对渗透敏感，在培养基上可形成油煎蛋状菌落，具有正常的繁殖能力实践意义；没有了细胞壁的机械固定，细胞及其柔韧，呈多样性，成为“滤过型细菌”。原生质体，球状体；

形成；用溶菌酶除尽原有的细胞壁，再用青霉素抑制新生细胞壁的合成，最后得到一层仅有细胞膜包裹的圆球状渗透敏感细胞

特点；无完整的细胞壁，细胞呈球状，对渗透压极其敏感，革兰氏染色阴性，细胞不能分裂，对相应噬菌体不敏感，无繁殖能力

实践意义；比正常有细胞壁的细菌更容易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体融合育种的良好材料

支原体；

形成；在长期进化中形成，适应自然生活条件

特点；细胞膜中含有甾醇，故机械强度较大

实践意义；青霉素等针对细胞壁杀伤的抗生物对其无效，但是抑制蛋白质合成的抗生素（四环素，红霉素等）和破坏含甾醇细胞膜结构的抗生素（制霉菌素，两性霉素等）对其有效。

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