羊产气荚膜梭菌的分离鉴定

一株羊源产气荚膜梭菌的分离及鉴定

金铎*1,2，林家琪1,2，董真1,2，展天松1,2，顾敏1,2，焦库华1,2，王彦红*1,2，刘文博*，1,2

（1，扬州大学兽医学院, 扬州，江苏， 225009；

2，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州，江苏，225009；）

摘要：2013年4月，扬州大学动物医院畜禽门诊接诊一例山羊急性死亡的病例，对其进行剖检，无菌恒温厌氧分离培养，纯化鉴别，革兰氏染色，生化反应，结果表明为产气荚膜梭菌，并对此进行了一定的讨论

关键词：产气荚膜梭菌；分离；鉴定。

产气荚膜梭菌旧名魏氏梭菌，产气荚膜杆菌，根据致死性毒素与其抗毒素的中和实验，将此菌分为A、B、C、D、E 5个类型，以菌体抗原进行血清型分类意义不大，菌体抗原与毒素分型之间没有明显关系，毒素至少已经发现15种，其中α、β、ε、ι、δ、θ、κ、λ、μ、υ、CPE、其他毒素、神经氨酸酶等。A型、C型、D型的某些菌株可以产生肠毒素，A型产气荚膜梭菌主要引起动物的气性坏疽，牛、羔羊、新生羊驼、驯鹿、仔猪、家兔的肠毒血症，B型菌主要引起羔羊痢疾，还可以引起犊牛、羔羊、山羊的肠毒血症或坏死性肠炎，C型菌是绵羊猝狙的病原。D型、E型菌也是导致牛羊肠毒血症和猪的腹泻[1]。笔者结合相关知识，在此整理于扬州大学动物医院所见的一例羊源产气荚膜梭菌感染的疾病。

1材料与方法

1.1病料来源

2013年4月，江苏某养殖户饲养的240多只母山羊陆续产羔，羔羊在产后24-48小时开始出现剧烈腹泻，拉水样黑色稀粪，虚弱，随后死亡，羔羊的死亡率达60%。剖检后发现病死羊羔严重脱水，真胃和大肠内容物呈糊状，小肠壁变薄，或黄或黑，透明，充满空气，部分肠道黏膜充血出血，卡他性出血性炎症,

*基金项目：江苏高校优势学科建设工程；江苏省大学生创新训练计划省级重点项目（201311117039Z）

作者简介：金铎（1992—），男，山东青岛人，扬州大学兽医学院本科生，主要从事羊临床菌株耐药性及质粒指纹图谱分析研究。

*通讯作者：王彦红，扬州大学兽医学院讲师，E-mail: wyh7405@

*通讯作者：刘文博，扬州大学兽医学院副教授，E-mail: lwb@

肝脏肿大。临床疑为产气荚膜梭菌感染，需进一步进行实验室检测。

1.2细菌分离

取山羊的肠道、肝脏、脾脏、肾脏等病变组织在无菌环境下接种与血琼脂平板上，在37℃条件下用烛缸厌氧罐进行厌氧培养24小时。然后在无菌条件下分

别挑取血平板上的单个菌落，在血平板和麦康凯琼脂近进行鉴别培养。取单个菌

落进行革兰氏染色，镜检。

1.3生化试验

利用细菌微量生化反应管（购于杭州微生物试剂有限公司，操作方法与判定标准参照该公司操作方法与标准）对所分离的菌株进行生化指标测定，利用牛乳

进行暴烈牛乳发酵实验。在37℃条件下培养24h，然后观察结果。

2结果

2.1细菌分离

取山羊的病变组织（肺脏）在无菌环境下接种于血琼脂平板上，37℃条件培养24h后出现表面光滑、半透明、圆屋顶状的菌落。菌落周围有溶血环，出现明

显的双溶血环，内环为完全溶血，外围为不完全溶血环。经过纯化培养，麦康凯

琼脂板上没有菌落生长。经过革兰氏染色镜检，结果菌体为直杆状，两端钝圆，

单个或成双的革兰氏阳性细菌，芽孢大而卵圆。肝脏，肾脏，脾脏与分离结果相

同。

2.2生化实验结果

分离菌接种在生化反应管后于37℃培养24h后，取出观察，分离细菌能发

酵葡萄糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖等，爆裂牛乳发酵实验呈现明显的阳性。其

他生化试验结果见下表(表1)。

表1生化实验结果

发酵反应

项目消化酪蛋白水解明胶酯酶卵磷脂酶葡萄糖麦芽糖乳糖蔗糖吲哚实验甘露醇硫化氢硝酸盐实验牛乳实验分离株+ + - + + + + + - - + + + 3讨论

本病例中病死山羊的肠道出现明显卡他性渗出并伴有出血症状，肝脏和肾脏出现坏死灶。分离菌株为直杆状，两端钝圆，单个或成双的革兰氏阳性细菌，芽孢大而卵圆。通过生化试验检验，结果表明病原菌与产气荚膜梭菌的生化反应结果一致，从而证明分离菌是产气荚膜梭菌。该病例的死亡率较高，对羊群危害较大。近年来，江浙一带地区养羊的人越来越多，产气荚膜梭菌对于草食动物的危害非常严重，本病的研究有重要意义。本病的防治重在饲养管理，保持环境，温湿度稳定。平时要注意搞好环境卫生，及时清理粪便，定期用生石灰、百毒杀等不同消毒剂杀灭环境中的病原体。不要突然更换饲料，平时可在饲料中添加微量元素硒，增加益生菌以调节肠道中的正常菌群平衡对减少本病的发生具有一定的临床效果［3］。加强对畜舍环境和粪便内产气荚膜梭菌的检测和监控有利于该病的防控，对暴发过该病的地区，需要掌握其流行形势以便于采取合理防治措施［4］。该疾病发展太快，治疗一般是没有太大效果。接种疫苗是预防本病的一种有效方法，预防羔羊痢疾、猝狙，肠毒血症等，可用三联菌苗和五联菌苗进行免疫防治。

由于产气荚膜梭菌病常呈急性散发, 目前尚无有效的治疗措施,治疗时一般遵循强心补液、解毒、镇静、调理肠胃的原则, 进行对症治疗；给予抗生素等药物, 如青霉素、四环素等,值得注意的是，磺胺嘧啶和多粘菌素类药物对产气荚膜梭菌生长没有抑制作用，对其他的细菌却有较强的抑制作用［5］，应用这两类

药物治疗产气荚膜梭菌感染往往不会得到理想的结果；采用同型的高免血清治疗, 对症加减, 也可收到一定的效果。中药治疗法, 采用能增加胃肠蠕动、清热解毒、凉血止痢、阻止瘟疫热毒进入机体的中药, 如黄芩黄连解毒汤加减, 煎水灌服, 每天2次,连用3～5d, 可收到良好的效果［6］。临床上，产气荚膜梭菌常与其他

菌混合感染，如巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等等［7］，在诊断和治疗的时候应格外注意，不能仅仅针对单一病原采取对症治疗措施而忽略可能的继发感染。

产气荚膜梭菌是羊肠道内正常菌，正常情况下数量有限，肠道菌群处于平衡状态，其发病原因主要与气候变化饲养管理不当或疫苗免疫失败等有关，如长期阴雨潮湿饲喂精料过多粗纤维含量较少，致使肠道正常菌群失调，产气荚膜梭菌