酵母双杂交自激活现象[优质PPT]

Y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m :
a g e n e t i c a s s a y f o r d e t e c t i n g p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s
S u p p o s e w e h a v e t w o p r o t e i n s . . .
酵母双杂交自激活 现象
一、原理
真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个 由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个 氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
D o th e s e p ro te in s b in d ?
Y X
X
Y
thusformingafunctional transcriptionactivator... X Y
our two hybrid X Y proteinsbind!
yes,wehaveexpressionof thereporterindicatingthat theproteinsbind!
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R e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n y e a s t
1. 将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。 2. 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震
荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角 瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。 3. 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到， 换单克隆重摇。 4. 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃， 230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.4~0.6。 5. 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 6. 室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。 7. 1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1×TE/LiAc重悬细胞，置冰 上，即成为酵母感受态细胞。 8. （只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。
GAL4分子的BD可以同上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS)结合。
AD则能激活UAS下游的基因进行转录。
单独的BD和AD都不能激活UAS的下游 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的转录激活功能。
Y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m :
a n d t h e q u e s t io n ,
XYBiblioteka d o t h e s e t w o p r o t e in b in d e a c h o t h e r ?
O n e w a y o fa n s w e r i n g t h i s q u e s t i o n i s t o u s e t h e y e a s tt w o h y b r i d m e t h o d .
tra n s c rip tio n a c tiv a to r
activatio nd o m ain D N A b in d in g d o m a in
U AS (upstreamactivationsequence)
tra n s c rip tio nm a c h in e ry gene
GAL4BD
自激活原理
Transcription factors
X
X
re p o rte r g e n e
His, β-gal
YPDA培养基
0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液
pH 6.5 灭菌 121℃ 15min
正对照：pGAL4 负对照： pBD-GAL4
酵母菌株感受态细胞制备：
d o w e g e t e x p r e s s i o n o f t h e r e p o r t e r ?
re p o rte r g e n e
His, β-gal
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。
tra n s c rip tio n a c tiv a to r
activatio nd o m ain D N A b in d in g d o m a in
U AS (upstreamactivationsequence)
tra n s c rip tio nm a c h in e ry gene
酵母转化
1. 鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。 2. 加入100μl酵母感受态细胞、1~2μl构建质粒（约200ng）、100μg鲑