分子生物学 第四讲 端粒和端粒酶

2、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT) 几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的 TERT 基因, 哺乳动物TERT 的转录由许多转录因 子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因 子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基 因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因, 并可与H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT 等癌基 因协同作用, 促进细胞无限增殖, 获得永生化并 发生癌变。
自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来， 越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性 肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。
美国学者在400多例来源于12 种不同组织的原发 肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8％， 而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4％。
附表 人体组织中端粒酶活性
电镜下的端粒T环结构
大多数有机体的端粒DNA由非常短而且数目精确的串
联重复DNA排列而成，富含鸟嘌呤，人类及其它脊椎 动物染色体端粒的结构是5′TTAGGG3′的重复序列, 长 约15kb。体细胞的端粒有限长度大多数明显短于生殖 细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随 着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚 合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。
1939年，Barbara McClintock（因为发现玉米的
转座子获得诺贝尔奖）发现玉米细胞的染色体 断裂末端容易融合，而正常染色体的自然末端， 为什么不容易相互融合呢？合理的推测是，染 色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端， 它应该有一个特殊的结构来避免染色体之间的 相互融合。 人们给了它一个专有名称-端粒（telomere）。
真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩
短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步 缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直 至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到 衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制 保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此。
荧光原位杂交显示端粒和端粒 DNA序列
2008年美国科学家利用X射线结晶学方法，揭示 了端粒酶（Telomerase）关键部位的三维结构图
端粒酶结构示意图。蛋白质（绿色）
与RNA（浅褐色）及DNA（紫色） 联合在一起。
四膜虫端粒酶对端粒DNA的复制模式图
端粒酶的爬行模型（动画演示）
端粒酶的功能
端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶， 它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒 酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆 转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对 RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能 稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和 干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。 在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNA 合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程: 受双链端粒结合蛋白包括RAP1 (芽殖酵母) 、存在 于t环的TRF1 (依赖于端粒酶)和TRF2(不依赖于端 粒酶)的负调控。
端粒和端粒酶发现大事记
1939年，Barbara McClintock发现玉米细胞的染色体断
裂末端容易融合 1972年，James Watson提出染色体复制的末端隐缩问题 1978年，报道四膜虫的端粒序列 1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明 1984年，报道酵母的端粒序列 1985年，报道四膜虫的端粒酶活性 1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基 1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基 1995年，报道酵母端粒酶活性 1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基,遗传筛选到 酵母端粒酶的催化亚基 1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基
1980年，在一次科学会议上，布莱克本为这个看似无
1984年，布莱克本的实验室发现酵母的端粒序列是由 形象地说，线性DNA就像一条鞋带，端粒就像两头的
塑胶套，没有塑胶套的保护，鞋带很容易劈叉，磨损， 直至散架
1984年，格雷德作为博士生加盟了布莱克本的实验室。
在捣碎无数的四膜虫之后，他们终于成功的分离了端 粒酶 。
五、端粒及端粒酶的结构特点
（一）端粒的结构及组成
端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。
由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。 端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重 复序列, 在生物进化过程中具有高度保守性。 不同物种的端粒DNA 序列存在差异。
端粒DNA由两条互相配对的DNA 单链组成, 其 双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2 结合 共同组成t环(t loops)。这种t 环特殊结构可维持染色 体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从 而使遗传物质得以完整复制。
端粒酶的RNA亚基是合成端粒DNA的模板，对于 端粒酶的结构和催化活性都十分重要.人端粒酶RNA有 455个核苷酸.端粒酶RNA重要序列缺乏保守性，但都 有保守的二级结构，端粒酶的RNA决定了端粒DNA的 序列。
1、端粒酶RNA 哺乳动物端粒酶RNAs在许多组织的不同发育阶段 ,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。 体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要， 影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端 粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的 末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。
在逐渐明晰了染色体末端特殊结构的概念之后，
二、端粒的基本性质
三、端粒的基本功能
四、端粒的研究历史
2009年10月5日，伊丽莎白・布莱克本、卡萝尔・格雷
德和杰克・绍斯塔克三位美国科学家一起获得了今年 的诺贝尔生理学或医学奖。关于他们获奖的原因，颁 奖词中这样描述：“他们解决了生物学的一个重大问 题：在细胞分裂时，染色体如何完整地自我复制以及 染色体如何受到保护以免于退化。这三位诺贝尔奖获 得者已经向我们展示，解决办法存在于染色体末端 ――端粒，以及形成端粒的酶――端粒酶。” 这是百年来诺贝尔奖第一次同时颁发给两位女性科学 家，他们3人将分享1000万瑞典克朗（约合966．7万元 人民币）奖金。
端粒DNA (Telomer)
TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端 5’ TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3’ (富含 G 链) 3’ AACCCC AACCCC AACCCC 5’ (富含 C 链)
（二） 端粒酶的结构
端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶。它是 一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖 方式每次添加一个核苷酸。
第四讲
端粒与端粒酶
沈晗
生命科学与Biblioteka Baidu物制药学院
一、端粒概念的提出
线性DNA复制过程中会出现一个问题，复制结束时，随从链的5’
末端的RNA引物会被细胞中的RNA酶所降解，因为缺乏3’-OH， 缺口不能被补上，所以每复制一轮，RNA引物降解后新生成的5’ 末端都将缩短一个RNA引物的长度 ，尽管这个引物不长，但是细 胞千千万万代地不断复制，如果不进行补偿，染色体不断缩短， 最终就会消失 ！ 1972年，James Watson首先提出了染色体复制的末端隐缩问题
布莱克本发现端粒序列所用到的简单模式生物四 膜虫
四膜虫的小染色体众多，也就说端粒可能非常丰富。
这就为端粒研究提供了得天独厚的材料。
1978年，布莱克本通过体外合成参入dNTP的实验，利
用四膜虫的染色体发现端粒的秘密。推断四膜虫的端 粒是由许多重复的5‘-CCCCAA-3’六个碱基序列组成的 。 趣的秘密找到了用武之地。这要感谢听她报告的绍斯 塔克。当时绍斯塔克正打算给酵母细胞人工合成一条 DNA。但是，光秃秃DNA的容易给酵母细胞中的核酸 酶吃掉。布莱克本和绍斯塔克一拍即合，决定给DNA 片段末端加上这些CCCCAA碱基序列结果让人大吃一 惊——人工DNA能够稳定的存在于酵母细胞内。 不太规则的TG1-3/C1-3A重复序列组成的。
六、端粒－端粒酶对与肿瘤的发生
“端粒－端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永 生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的 端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。 相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永 生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶 对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。
肿瘤部位/类型 肺 与肿瘤邻近正常组织/ 良性病变 3/68（4.4%） 肿瘤组织（%） 109/136（80.1%）
乳腺
前列腺 结肠
2/28（7.1%）
1/18（5.6%） 0/45（0）
19/24（79.6%）
23/27（85.1%） 22/23（95.6%）
肝
卵巢 肾 神经母细胞瘤 血液（淋巴瘤，CLL ALL） 脑 其它（头顶部，Wilms瘤）
端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶
端粒酶RNA(hTR)
端粒酶逆转录酶（TERT）
端粒酶结合蛋白（TEP）
端粒酶示意图
端粒酶活性取决于它的RNA和蛋白质亚基.端粒酶至少 包含两个活性位点.端粒酶除了具有反转录活性外，还 具有核酸内切酶的活性。另外一个重要的功能就是合 成串联重复的TTAGGG序列，为TRF2提供结合位点， 防止染色体的末端融合。
这个端粒酶的名字有点与众不同。我们一般在给酶命
名时，都以它的作用对象命名。比如，分解淀粉的叫 做淀粉酶，分解蛋白质的叫做蛋白酶。而端粒酶刚好 相反，它是以产物命名。更有意思的是，它合成端粒 的DNA片断是自带的。也就是说，端粒酶相当于一个 小作坊，自己为合成端粒DNA提供复制所需的原材料， 完成添加端粒所需的重任。
3、端粒酶相关蛋白(TEP)
⑴ 端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白， 对端粒酶活性起调节作用 ⑵ 生存动力神经细胞基因(SMN) 产物 热休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT转录后修饰的 蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。 PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。 ⑶ 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端 粒酶的功能有关。Est1p 足以使端粒延长。但是,在无 Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端 粒长度。
端粒和端粒酶的一系列发现完美地解释了这两个问题：
染色体末端的DNA由简单重复的端粒序列构成，端粒
（保护着染色体末端，使之区别于一般的断裂染色体 末端，而不被各种酶降解，相互之间不会融合。
端粒酶负责端粒的复制，端粒酶的催化亚基利用端粒
酶自己的RNA亚基作为模板通过转位不断重复复制出 端粒DNA，从而补偿在染色体复制过程中的末端隐缩， 保证染色体的完全复制
三位获奖科学家
3位获奖者中，布莱克本最具名望，2007年曾入选《时
代》百大最具影响力人物。其余两位得主都是自她的 研究得到启发，并与她合作取得成果。除了科研了得， 她的敢言作风亦为人称道，她曾获美国前总统小布什 委任入生物伦理委员会，但她在布什禁止干细胞研究 后，公开批评他以意识形态干预科学研究，2004年被 辞退。 布莱克本出生于澳大利亚，来自一个医生世家，家人 期望她从医，但她却决意要走科研之路。1971年，她 在英国剑桥大学攻读博士学位，师从诺贝尔得主桑格 （Fred Sanger）。 1975年获得博士学位后，她转到耶鲁大学，开始研究 端粒。1978年在加利福尼亚大学伯克利分校建立实验 室，经过不懈努力，终取得重大发现 。
端粒酶在人体细胞永生性转化中
端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失
M1期阻滞
细胞分裂停止 ↓
SV40T抗原
Rb、P53与病毒蛋白结合、突变
M1—M2期间隔
双着丝粒形成 ↓ M2期退化 染色体失稳
永生化
端粒酶被激活
细胞凋亡
端粒变化与肿瘤发生
尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端 粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematire Lengthening of telomere ALT）机制，但其存在上并 不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。