生物显微技术 切片的制作
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石蜡切片的制作
石蜡切片的过程
❖ 动物的处死 ❖ 动物组织取材 ❖ 固定 ❖ 组织固定后的处理 ❖ 脱水和透明 ❖ 包埋 ❖ 切片
一、动物的处死
❖ 麻醉 ❖ 空气栓塞 ❖ 颈椎脱臼或断头 ❖ 股动脉放血
二、动物组织取材
❖ 动物组织取材原则： 尽量保持组织的生活状态。
❖ 动作要快 ❖ 不要过度用力夹捏组织，
苯两次，保证透明完全。
六、包埋
包埋剂的特点： ❖ 具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。 ❖ 能完全进入组织。 ❖ 对组织内部成分损伤小。
石蜡包埋
❖ 石蜡特点：熔点：45-50℃ 软蜡
❖
55-60℃ 硬蜡 常用
❖ 石蜡的处理：
新蜡应溶一次，增加密度。
并用滤纸过滤去处杂质。
加5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。
❖ ③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组 织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。
固定时间的选择
❖ 不同的研究目的所需使用的固定液。 ❖ 材料的大小，组织的特性与致密度。 ❖ 温度的不同有所差别。
组织固定后的处理
❖ 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定
液造成的人为假象。
❖ 修块:大小合适、去除形态不好的部分，
❖ 优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄 的切片，并且易于制成连续切片，也容易附 着于载玻片上。
❖ 缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱 水、浸蜡的过程中容易收缩。
火棉胶切片法
❖ 透明剂：乙醚与乙醇等量混合
❖ 包埋剂：火棉胶溶于透明剂
❖ 包埋：常温进行
❖ 凝固：在乙醚中过夜，
❖
在氯仿中过夜。
❖ 在70%乙醇中保存。
❖ 优点：可切大的组织
❖
可切较硬的组织如硬骨
❖ 缺点：操作所用时间长
❖
一般切片厚度为20-30μm。
❖
不能连续切片
❖
全部试剂为易燃物质，注意防火
冰冻切片法
❖ 取材：液氮保存 ❖ 载玻片处理 ❖ 切片 ❖ 保存：-70℃ 或-20℃
❖ 要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间
❖
不能过度脱水（使组织变脆）
❖ 不同组织脱水时间不同：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
❖ 大的致密的组织需要延长脱水时间
❖ 为加速各级酒精的穿透力，脱水可
在37℃温箱中进行。
五、透明或媒浸
目的与作用 ❖ 对组织的最后脱水处理 ❖ 与包埋剂置换 透明剂： 苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有
机溶剂 ❖ 100%乙醇脱水后进入二甲
四、脱水
❖ 脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。
❖ 脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等
❖ 乙醇：最常用的脱水剂
❖ 一般组织：70%---80%----90%--100%--- 100%
❖ 特殊组织：30%--40--%--50%---60%---70%--80%---90%--100%--- 100% 每步30分钟左右。
Bouin’s液
❖ 苦味酸饱和水溶液 ❖ 37%-40%福尔马林液 ❖ 冰醋酸
75ml 25ml 5ml
15 固定糖原 5 固定蛋白和脂肪 1 凝固核染色质
固定组织时应注意：
❖ ①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定 处理。
❖ ②组织块不易过大过厚，必须小于 2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控 制在0.3cm以内。
反复溶的旧蜡包埋效果更好。
❖ 程序：在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。
❖ 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中两 次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。
❖ 包块：在室温进行
七 石蜡切片
❖ 载玻片处理： ❖ 切片： ❖ 展片：背面与玻片。 ❖ 烘片：37℃的温箱内烤干(约需12小时)。
电镜观察切片的固定与染色。
丙酮及醇类固定剂
❖ 丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以 单独使用，低温下保持酶活性效果好。
❖ 乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多 肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂 混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态 保存不良。
混合固定剂
❖ 固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组 织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂 混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂 对组织所致的缺陷。
❖ 灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。 达到充分固定之目的。
3、固定液
❖ 醛类固定剂 ❖ 非醛类固定剂 ❖ 丙酮及醇类固定剂
醛类固定剂
❖ 双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。 ❖ 包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛 ❖ 通常与其他的试剂联合使用 ❖ 优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存
蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。 ❖ 缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着
色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血 红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。
非醛类固定剂
❖ 氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂 ❖ 重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。
❖ 苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂， ❖ 醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。 ❖ 蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。 ❖ 四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与
❖ 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4
❖ 成分： 4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中，
❖ 1倍的磷酸缓冲液:PBS
MV
❖ NaCl
140mM
❖ KCl
2.7mM
❖ NaH2PO4•12H2O， 10mM
❖ KH2PO4 ❖ 调pH至7.4。
1.8mM
58.44 74.55 358.14 136.09
防止组织变形。
三、固定
❖ 1、目的： 尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变
化、自溶。 保持细胞和组织原有的形态结构， 保持组织内部成分特征不发生变化。 ❖ 2、方式：浸入式
灌注式
灌注式
❖ 此法适用于动物实验研究。自左心室插入主 动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊 筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材， 投入固定液。
石蜡切片的过程
❖ 动物的处死 ❖ 动物组织取材 ❖ 固定 ❖ 组织固定后的处理 ❖ 脱水和透明 ❖ 包埋 ❖ 切片
一、动物的处死
❖ 麻醉 ❖ 空气栓塞 ❖ 颈椎脱臼或断头 ❖ 股动脉放血
二、动物组织取材
❖ 动物组织取材原则： 尽量保持组织的生活状态。
❖ 动作要快 ❖ 不要过度用力夹捏组织，
苯两次，保证透明完全。
六、包埋
包埋剂的特点： ❖ 具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。 ❖ 能完全进入组织。 ❖ 对组织内部成分损伤小。
石蜡包埋
❖ 石蜡特点：熔点：45-50℃ 软蜡
❖
55-60℃ 硬蜡 常用
❖ 石蜡的处理：
新蜡应溶一次，增加密度。
并用滤纸过滤去处杂质。
加5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。
❖ ③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组 织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。
固定时间的选择
❖ 不同的研究目的所需使用的固定液。 ❖ 材料的大小，组织的特性与致密度。 ❖ 温度的不同有所差别。
组织固定后的处理
❖ 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定
液造成的人为假象。
❖ 修块:大小合适、去除形态不好的部分，
❖ 优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄 的切片，并且易于制成连续切片，也容易附 着于载玻片上。
❖ 缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱 水、浸蜡的过程中容易收缩。
火棉胶切片法
❖ 透明剂：乙醚与乙醇等量混合
❖ 包埋剂：火棉胶溶于透明剂
❖ 包埋：常温进行
❖ 凝固：在乙醚中过夜，
❖
在氯仿中过夜。
❖ 在70%乙醇中保存。
❖ 优点：可切大的组织
❖
可切较硬的组织如硬骨
❖ 缺点：操作所用时间长
❖
一般切片厚度为20-30μm。
❖
不能连续切片
❖
全部试剂为易燃物质，注意防火
冰冻切片法
❖ 取材：液氮保存 ❖ 载玻片处理 ❖ 切片 ❖ 保存：-70℃ 或-20℃
❖ 要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间
❖
不能过度脱水（使组织变脆）
❖ 不同组织脱水时间不同：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
❖ 大的致密的组织需要延长脱水时间
❖ 为加速各级酒精的穿透力，脱水可
在37℃温箱中进行。
五、透明或媒浸
目的与作用 ❖ 对组织的最后脱水处理 ❖ 与包埋剂置换 透明剂： 苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有
机溶剂 ❖ 100%乙醇脱水后进入二甲
四、脱水
❖ 脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。
❖ 脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等
❖ 乙醇：最常用的脱水剂
❖ 一般组织：70%---80%----90%--100%--- 100%
❖ 特殊组织：30%--40--%--50%---60%---70%--80%---90%--100%--- 100% 每步30分钟左右。
Bouin’s液
❖ 苦味酸饱和水溶液 ❖ 37%-40%福尔马林液 ❖ 冰醋酸
75ml 25ml 5ml
15 固定糖原 5 固定蛋白和脂肪 1 凝固核染色质
固定组织时应注意：
❖ ①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定 处理。
❖ ②组织块不易过大过厚，必须小于 2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控 制在0.3cm以内。
反复溶的旧蜡包埋效果更好。
❖ 程序：在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。
❖ 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中两 次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。
❖ 包块：在室温进行
七 石蜡切片
❖ 载玻片处理： ❖ 切片： ❖ 展片：背面与玻片。 ❖ 烘片：37℃的温箱内烤干(约需12小时)。
电镜观察切片的固定与染色。
丙酮及醇类固定剂
❖ 丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以 单独使用，低温下保持酶活性效果好。
❖ 乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多 肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂 混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态 保存不良。
混合固定剂
❖ 固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组 织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂 混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂 对组织所致的缺陷。
❖ 灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。 达到充分固定之目的。
3、固定液
❖ 醛类固定剂 ❖ 非醛类固定剂 ❖ 丙酮及醇类固定剂
醛类固定剂
❖ 双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。 ❖ 包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛 ❖ 通常与其他的试剂联合使用 ❖ 优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存
蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。 ❖ 缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着
色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血 红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。
非醛类固定剂
❖ 氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂 ❖ 重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。
❖ 苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂， ❖ 醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。 ❖ 蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。 ❖ 四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与
❖ 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4
❖ 成分： 4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中，
❖ 1倍的磷酸缓冲液:PBS
MV
❖ NaCl
140mM
❖ KCl
2.7mM
❖ NaH2PO4•12H2O， 10mM
❖ KH2PO4 ❖ 调pH至7.4。
1.8mM
58.44 74.55 358.14 136.09
防止组织变形。
三、固定
❖ 1、目的： 尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变
化、自溶。 保持细胞和组织原有的形态结构， 保持组织内部成分特征不发生变化。 ❖ 2、方式：浸入式
灌注式
灌注式
❖ 此法适用于动物实验研究。自左心室插入主 动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊 筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材， 投入固定液。