分子生物学课程论文(精)

PCR技术发展与应用的研究进展

王亚纯 09120103

摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR 是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR 技术是克服了原有的PCR 技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR 技术快速PCR 在保证PCR 反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR 技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR 技术、快速PCR 技术、mRNA 差异显示PCR 技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。

关键字：定量PCR ；荧光PCR ；快速PCR ；DNA 聚合酶；mRNA 差异显示PCR

0 前言

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR 技术由于PCR 简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR 技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。鉴于此，对PCR 产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR ，Q-PCR 方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR 和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR 。

随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR 反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR。快速PCR 技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR 在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与

否；同时，由于PCR 已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR 的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。近年来，快速PCR 技术得到了可喜的进展。从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。

生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。研究基因差异表达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术[3]和mRNA 差异显示PCR 技术等(mRNA Differential Display PCR，简称DD-PCR [4] 。迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。尤其是mRNA 差异显示PCR 技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA 的量极少，不需要纯化的

mRNA ，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。现将定量PCR 技术、快速PCR 技术、mRNA 差异显示PCR 技术研究情况作一综述作简要综述。

1 定量PCR 技术

定量PCR （Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR 技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR 终产物的分析或PCR 过程的监测，进行PCR 起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR 技术（严格意义的定量PCR 技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR 过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零。广义概念下的定量PCR 技术可以分为五种类型：

（1）外参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

（2）内参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

（3）外标法+过程监测，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。

（4）内参法+过程监测，由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq 酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。

（5）外标法+过程监测+内对照，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。

1.1 竞争性PCR 技术

定量PCR 技术是对传统PCR 技术的进一步发展和补充，在定量过程中需借助各种形式的参照物。参照物是一种已知含量的标准模板，按其是否与待测样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照。鉴于PCR 扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差异，理想的定量PCR 应该使用内参照。竞争性PCR 即是采用内参照的一种定量PCR 方法，通过消除管间及样品间的变异，从而达到较为精确的基因定量[10]。该方法是将待测基因与已知浓度的内参照模板在同一反应管中共同扩增，由于二者具有相同引物的结合位点并采用同一引物进行扩增，因此二者竞争引物、脱氧核苷酸以及DNA 聚合酶，以致当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物就会逐渐减少。两模板的扩增产物量可分别用以下公式表示：Y 待测= X 待测(1+En；Y 内参照= X 内参照(1+En，其中X 待测为起始拷贝量；Y 待测为扩增产物量。由于在同一反应体系中扩增，两模板的循环次数n 保持一致，如果使两者间的扩增效率E 也相同，就存在如下关系：Y 待测/Y内参照= X 待测/X内参照。当两模板的产物量相同时，则两模板的反应起始拷贝数相等，由此可对待测模板进行精确定量。具体检测方法是将已知浓度的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因一起扩增，以参照模板的起始拷贝数为横轴，以两模板扩增产物量的比率为纵轴，作出标准曲线，纵坐标为1的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测