第六章核糖体和核酶

1. 发现核糖体及核糖体功能鉴定的两个关键技术是什么?

答: 核糖体最早是Albert Claude于1930s后期用暗视野显微镜观察细胞的匀浆物时发现的，当时称为微体(Microsomes)，直到1950s中期，George Palade在电子显微镜下观察到这种颗粒的存在。当时George Palade和他的同事研究了多种生物的细胞，发现细胞质中有类似的颗粒存在，尤其在进行蛋白质合成的细胞中特别多。后来Philip Siekevitz用亚细胞组份分离技术分离了这种颗粒，并发现这些颗粒总是伴随内质网微粒体一起沉积。化学分析揭示，这种微粒富含核苷酸，随之命名为ribosome，主要成分是核糖体RNA(rRNA)，约占60%、蛋白质(r蛋白质)约占40%。核糖体的蛋白质合成功能是通过放射性标记实验发现的。将细胞与放射性标记的氨基酸短暂接触后进行匀浆，然后分级分离，发现在微粒体部分有大量新合成的放射性标记的蛋白质。后将微粒体部分进一步分离，得到核糖体和膜微粒，这一实验结果表明核糖体与蛋白质合成有关。两个关键技术是亚细胞组份分离技术和放射性标记技术。

2．说明人体单倍体染色体组中四种rRNA基因的组成、排列方式和拷贝数。答: 在人基因组的四种rRNA基因中，18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一起的，每个基因被间隔区隔开，5S的rRNA基因则是编码在另一条染色体上。前3个基因组成一组，分布在人的13、14、15、21、22 等5条染色体上。在间期核中，所有这5条染色体rRNA基因区域，转录时聚集在一起，形成一个核仁。在人体单倍体染色体组中，每组rRNA基因有200个拷贝。每一拷贝为一个rDNA转录单位。这3个基因是纵向串联排列在核仁组织者的DNA上。真核细胞核糖体的5S rRNA基因则是独立存在于一个或几个染色体上，拷贝数达几千个。在人的细胞中，该基因的拷贝有24000个之多，它们串联排列在1号染色体接近末端处。

3．根据3H标记的尿嘧啶和放线菌素D研究人的培养细胞前体rRNA的合成，推测出前体rRNA的加工过程，请问3H标记的尿嘧啶和放线菌素D各起什么作用?

答: 3H标记的尿嘧啶是追踪RNA的，而加入放线菌素D是为了阻断RNA的合成，这样随着RNA加工的进程，rRNA分子越来越小，便于判断。如果不阻断RNA合成，新合成的45SrRNA就会干扰判断。在上述的研究中发现，当人的细胞同3H标记的尿嘧啶共培养25分钟后，被标记rRNA 的沉降系数是45S，加入放线菌素D阻断RNA的合成后，标记的45S rRNA首先转变成32S的rRNA，随着培养时间的延长，逐渐出现被标记的28S、18S的rRNA。

4. 有人用核糖体重组实验得到一些重要的结论，你能说出一、二吗?

答: 这些结果包括以下几个方面：①30S亚基的蛋白质专同16S rRNA结合; 50S 亚基的蛋白质只同23S rRNA结合，如果把30S亚基rRNA和50S 亚基的蛋白质相混合，则不能装配成有功能的亚基。②从不同种细菌提取30S 亚基的rRNA 和蛋白质，可装配成有功能的30S 亚基，这表明不存在种间差异。③原核生物核糖体与真核生物核糖体的亚基彼此不同，由二者的rRNA和蛋白质重组后的核糖体没有功能。④大肠杆菌的核糖体与玉米叶绿体核糖体亚基重组后具有功能。⑤由于不同生物的线粒体核糖体大小不同，由55S到80S不等，而原核生物的核糖体基本稳定，所以线粒体的核糖体亚基同原核生物核糖体亚基相互交换形成的杂合核糖体没有功能。

5. 真核细胞中核糖体的合成和装配过程如何?

答: 整个过程相当复杂，首先要合成与核糖体装配有关的蛋白质，这些蛋白质

包括核糖体结构蛋白和与前体rRNA加工有关的酶。它们都是在细胞质的游离核糖体上合成，然后迅速集中到细胞核并在核仁区参与核糖体亚基的装配。而组成核糖体亚基的18S rRNA、5.8 SrRNA和28S rRNA基因则是在核仁中边转录边参与核糖体亚基的装配，5S rRNA却是在细胞核中转录后运送到核仁中参与核糖体亚基的装配。装配过程中，45S RNA、5S RNA同蛋白质形成80S RNA颗粒，然后80S 颗粒被降解成大小两个颗粒，大颗粒为55S，含有32S 和5S两种RNA，小颗粒含有20S的前体rRNA。然后，小颗粒中的20S RNA前体被快速降解成18S 的rRNA，并运送到细胞质中，即是成熟的核糖体小亚基。55S大颗粒中的32S RNA被加工形成28S和5.8S 两种rRNA成为成熟的大亚基后，被运送到细胞质中，这个过程比较慢。如果这时有mRNA同小亚基结合的话，大亚基即可结合上去形成完整的核糖体，并进行蛋白质的合成。

6. 二十世纪六十年代初期Robert Perry发现核糖体的合成是在核仁中进行的，请问他是如何发现的?

答: 二十世纪六十年代初期Robert Perry用紫外微光束破坏活细胞的核仁，发现破坏了核仁的细胞丧失合成rRNA的能力，这一发现提示核仁与核糖体的形成有关。后来Perry又发现低浓度的放线菌素D能够抑制3H-尿嘧啶掺入rRNA中，而不影响其他种类的RNA合成。显微放射自显影也显示放线菌素D能够选择性阻止核仁RNA的合成，表明核仁与rRNA的合成有关。

7. 原核生物蛋白质合成起始复合物形成包括哪些过程?需要哪些因子参与?

答: 主要分为三步，参与的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、转运tRNA、GTP等。①30S亚基与mRNA的结合mRNA不能与完整的核糖体结合，但是能够同独立存在的30S核糖体小亚基结合。在原核生物中，30S核糖体小亚基通过16S rRNA与mRNA起始密码子AUG上游的SD序列的互补，从而与mRNA结合。核糖体小亚基与mRNA的结合还需要起始因子(initiation factor. IF)的帮助，原核生物的起始因子命名为IFs，真核生物的起始因子命名为eIFs。原核生物有三种起始因子，其中有两种(IF1、IF3)通过与30S核糖体亚基的结合帮助30S亚基与mRNA的识别与结合。②第一个aa-tRNA进入核糖体当mRNA与核糖体小亚基结合后，携带甲酰甲硫氨酸的tRNA通过反密码子与mRNA中AUG的识别从而进入核糖体。起始tRNA在与mRNA形成mRNA-30S亚基复合物之前，必须同GTP、起始因子IF2结合，形成GTP-IF2-tRNAfMet复合物。起始tRNA 复合物与mRNA的AUG密码子结合后，释放IF3。③完整起始复合物的装配一旦起始tRNA与AUG密码子结合，核糖体大亚基就加入到复合物中形成完整的核糖体-mRNA起始复合物。该过程伴随GTP的水解、IF1和IF2的释放。其中GTP的水解可能引起核糖体构型的变化，而改变了的构型正是蛋白质合成所必需的。

8. 请详细说明多肽链延伸的过程。

答: 蛋白质合成的肽链延伸涉及四个重复的步骤∶①氨酰tRNA进入核糖体的A 位点；②肽键形成；③转位;④脱氨酰tRNA释放。上述四步的循环，使肽链不断延长。在整个过程中，需要GTP和一些延长因子的参与。①氨酰-tRNA进入A位由于起始tRNA占据P位点，核糖体开始接受第二个氨酰-tRNA进入A位点，此即为延伸的第一步。第二个氨酰-tRNA在进入A位点之前，必须与结合有GTP的蛋白延伸因子结合(原核细胞中延伸因子是Tu，真核生物则是eEF1)。Tu起传递作用，即将氨酰-tRNA传递给核糖体。虽然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP都有可能进入A位，但只有反密码子与A位点密码子相匹配的tRNA才允许进入