免疫学实验教学课件

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双向琼脂扩散试验
3．向1-6孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1： 32，1：64稀释的抗体，每孔10微升，此时加入 的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。
4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散 24小时。
5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形 成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致 密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未 出现沉淀线则为阴性反应。 根据在哪个血清稀释 度下不出现沉淀反应，确定前一个稀释度为该血 清的免疫效价。
• 抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现 可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体 的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗 体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部 位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分 的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方 式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免 疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳试 验。
单核细胞：
体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。 核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞 的核。直径14-20微米。
肥大细胞：
胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的 嗜硷性颗粒。其中含肝素、组织胺等物质。常成 群地分布于血管的周围，主要为组织细胞。
浆细胞：
细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜 硷性。核圆形，着色深，多偏于细胞的一 侧，染色质核膜呈车轮分布。正常组织浆 细胞少，慢性炎症时增多。
– 以微量进样器吸取生理盐水0.05毫升加入第二管。 – 用微量进样器吸入抗原稀释液0.05毫升加入各管，加时
应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上， 使成一明显界面，切勿使之相混。 – 置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环， 若有则为阳性。
琼脂扩散试验
• 琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀 反应。
• 时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，1421天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观 察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。
实验三 血凝与血凝抑制实验
实验目的 1.掌握血凝与血凝抑制实验的原理和方法。
2. 了解该方法在病毒学检测中和临床中的 作用。
实验原理
血凝实验：利用病毒表面的血凝素抗原具有的凝血
免疫学实验
授课老师：王晓杜
实验一 与免疫相关的细胞形态的观察
目的要求： 观察与免疫相关的几种细胞的形态，了
解它们在机体免疫反应中的作用。
血涂片的制作方法
（1）沾一滴血在干净载玻片右端。 （2）另取一边缘光滑平齐的玻片作为推片，
推片与载片约成20～30°，并与血滴接触， 使血滴在玻片边缘散开，迅速将玻片推向 左方。
影响琼脂扩散的因素
• 温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常 反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变 形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室 温或冰箱（4℃）中为佳。
• 琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度 越大，沉淀线出现越慢。
• 参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗 原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片 法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。 当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍 对沉淀线数目的确定。
双向琼脂扩散试验
材料： 1．抗体：兔抗HA的免疫血清 2．抗原：HA蛋白 3．其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、
打孔器、载玻片、湿盒等。
双向琼脂扩散试验
• 方法：
1．取一清洁载玻。
2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5 毫米。孔的排列方式如图所示。 中心孔加 入10微升抗原。
（ 3）作成一均匀和厚度适中的血涂片。 （4）瑞特氏染色。将已干的血片滴上染色液，
经染色3-5分钟，用水冲洗或吸干，待干燥 后即可观察。
观察方法：
先在低倍镜下观测，找到血细胞分布比较 均匀，有核细胞（白细胞）比较多 的区域， 然后在油镜下观察。
红细胞：
淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为 双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅， 直径7—8微米。
嗜碱性颗粒白血球：
体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小 不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球 的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。直径10—11 微米。
淋巴细胞：
涂片中可观察到中、小型两种。小淋巴 细胞与红血球大小相似，圆形。其中含致 密的核，染成深紫色。周围仅有一薄层嗜 硷性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大， 有较宽层的细胞，核圆形。6-8微米。
原始浆细胞
浆细胞
巨噬细胞：
又称组织细胞，细胞形态不规则。常伸 出短而钝突起，有很强的吞噬能力
实验二 沉淀反应
可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解 质存在的条件下，两者比例适合，即可有 沉淀物出现，叫沉淀反应（Precipitation）.
沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、 荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。此外 还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。
嗜中性颗粒白血球：
体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶 状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染 色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒 被染成紫红色。直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：
略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色， 通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被 染成鲜红色。直径10—15微米。
活性，使得动物红细胞发生凝集现象。从而测定该病毒的 感染发生和凝集效价。是指示病毒感染和评价病毒的生物 学活性的重要方法。
血凝抑制实验：抗体与病毒结合后，抑制病毒凝集
红细胞的能力，从而可以测定出血清的效价。通常用来评 价免疫效果和疾病监测。
（一）环状沉淀反应
当抗原与相应抗体形成一个接触面时， 如二者比例适当，接触面上可形成一个乳 白色的环状物即为阳性沉淀反应。
（一）环状沉淀反应
材料： 1.抗体：兔抗HA血清。 2.抗原：HA蛋白 3.小沉淀管、毛细吸管、生理盐水。
（一）环状沉淀反应
• 方法：
– 取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗体血清约0.05毫升， 加入第一管，加时注意不能有气泡。