医学免疫学实验课

医学免疫学实验课
免疫学教研室 李宗喜 5346
第一部分
体液免疫实验
实验一

对流免疫电泳 凝集实验 动物免疫
对流免疫电泳操作步骤
1.打孔：用直径3mm的打孔器成对打孔，孔 距为8-10mm。 2.加样：用微量加样器将10μl（勿溢出） 待检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗 人IgG血清加到阳极（左侧）侧孔内。 3.电泳2.5h。
免疫电泳
免疫电泳
凝集反应
在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可 溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体 （或抗原），在电解质存在的条件下出 现凝集物的现象，称凝集反应。
试管法凝集试验 直接凝集反应 玻片法凝集试验
试管法凝集试验
效价： 将待检血清进行倍比稀释后，加入等量抗 原进行反应。其中能够凝集抗原的最大血清稀 释倍数为血清的效价。
单向免疫扩散
将抗体预先混入琼脂中，铺板，然后 在板上打孔，孔中加入抗原。因为抗原能 在琼脂中扩散，所以在抗原抗体比例适宜 处形成白色沉淀环。环的直径与抗原量成 正相关。
结果分析
18 36 72 144 288
S
N
稀释倍数 350 300 250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 直径 y = 2103.8e - 0 . 3 1 2 5 x
二、玻片法凝集试验
试剂与器材
1. 2. 3. 4. 人外周血红细胞 抗－A及抗－B标准血清 生理盐水 载玻片、采血针、消毒棉球等
操作方法
1.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明 号码。于第一格和第二格内各加一滴抗A及抗B标 准血清，第三格内滴加一滴生理盐水。 2.用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的三 个角分别取血，加入1、2、3 格内。 3.轻轻摇动玻片，经1～2 分钟后用肉眼观察结果， 出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀 混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻 片放于低倍显微镜下观察。
间接凝集抑制实验
将待检可溶性抗原与标准抗体混合，再加入 标准抗原结合的载体微球。待检抗原与标准抗原 竞争结合标准抗体，导致凝集现象被抑制。
间接凝集抑制实验原理
小鼠抗体水平的检测
一、免疫血清制备
二、血清分离 三、酶联免疫吸附试验（ELISE）检测抗体
三、腹腔免疫


动物：昆明鼠6-8周，雌性 抗原：绵羊红细胞（SRBC） 腹腔注射：5%的SRBC注射2ml
影响抗原-抗体反应的因素

电解质：0.85%氯化钠 温度：37℃ 酸碱度：pH6-8
沉淀反应
可溶性抗原（如细菌培养滤液、外毒 素、血清蛋白等）与相应的抗体结合，在 一定条件（适量的电解质，合适的酸碱度 和温度）下，形成肉眼可见的沉淀现象， 这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称 为沉淀原(precipitinogen)，其相应抗体 称为沉淀素(precipitin)。
火箭免疫电泳
双向免疫扩散
当抗原和抗体加入含有适量电解 质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向 四周扩散，若两者相互对应，分子比 例适合，在扩散一定时间后在两孔之 间相遇并结合生成白色沉淀线。
结果分析
•沉淀线位置靠近浓度较小的一方 •沉淀线弯曲向分子量较大的一方
Ab
Ag
一、对流免疫电泳
对流免疫电泳试验是将双向免疫扩 散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散 技术。蛋白质抗原、抗体在电场中作定 向加速度双向免疫扩散，从而加速沉淀 线的形成。
电渗作用
电渗是在电场中液体对于固体支持物 的相对移动。由于琼脂中含有SO42-，带负 电荷，造成静电感应致使附近的水带正电 荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力， 即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电 荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移 动得更快。如果物质向正极移动，所带电 荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极 移动，血清中的γ球蛋白就是如此。
血清抗体的检测 抗体生成细胞的检测
其它的抗原抗体反应
凝集反应 沉淀反应 细胞免疫应答
实验四
腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
实验一
体液免疫应答
抗体的检测
其它抗原抗体反应
血清抗体的检测
凝集反应
沉淀反应
动物免疫
ABO血型的鉴定
对流免疫电泳
体液免疫试验流程
动物免疫
血清分离，细胞提取 指标检测 经典抗原抗体反应
操作方法
1.打孔：用直径3mm的打孔器成对打孔，孔 距为8-10mm。（注意：尽量别打裂） 2.加样：用微量加样器将10μl（勿溢出） 待检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗 人IgG血清加到阳极（左侧）侧孔内。 3.电泳2.5h。
8mm
+
左 兔抗人IgG血清 待检血清
右
结果判断


待检孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性， 否则为阴性。 在黑色背景上方，用散射光多个角度观察， 在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应 出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极 微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可 增强沉淀条纹的清晰度。
对流免疫电泳示意图
Ag
Ab
＋＋
＋＋ ＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋ ＋＋
-
PH=8.6
+
＋
Na+
羧基糖
主要试剂与器材
1.兔抗人免疫血清 2.待检人血清 3.阴性对照血清 4.pH8.6巴比妥缓冲液 5.琼脂 6.电泳仪 7.载玻片、打孔器、微量加样器
步骤
1.浇板：用5～10ml吸管吸取溶化的15g/l琼脂巴 比妥溶液4ml，浇注于洁净载玻片上。 2.打孔：待琼脂凝固后，用直径3mm的打孔器成 对打孔，孔距为10mm。 3.加样：用微量加样器将10μl待检血清加在阴 极侧孔内（左侧），诊断血清加到阳极侧孔内 （右侧）。然后将琼脂板置于电泳槽中，槽两 侧搭用纱布或两层滤纸做盐桥（5×6.5cm）。 每端约贴上1cm，其余浸入缓冲液中。 4.电泳：接通电源，控制电流强度在2～3mA/cm 板宽，电泳2.5h。
小鼠抓取方法
用左手拇指和食指捏住小鼠尾 巴中部，放在铁笼上，小鼠自 然向前挣扎； 用另外三个手指压住小鼠的尾 巴根部握入手掌； 放松拇指和食指，用另外三个 手指控制小鼠尾部，然后用食 指和拇指捏住小鼠头部两边疏 松的皮肤提起小鼠； 注意：小鼠尾巴的尾端容易断 裂，抓小鼠应抓尾巴中部或根 部。
8mm
+
左 兔抗人IgG血清 待检血清
右
注意事项





打孔无裂缝 孔勿靠近琼脂边缘 加样不溢出 加样无气泡 清洗加样器
要求





准时 白大衣 认真记录 爱惜实验室 水、电、煤气 名单 课堂 体液免疫应答
实验一、二、三
抗体的检测
沉淀反应：对流免疫电泳 凝集反应：ABO血型鉴定 小鼠抗体水平的检测 抗体生成细胞检测：溶血空斑试验 血清中抗体水平的测定：ELISA

抗原-抗体反应
概念：
体内外发生的高度特异性结合反应， 其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗 原结合位点的结构互补。 特点： 特异性 非共价键结合 比例要适当
实验原理



在偏碱性的缓冲液和电场中，大部分抗原 带负电荷，向阳极泳动； IgG 等电点与缓冲液的 pH 接近，故极性基 团解离很少，负电荷少； IgG 分子量大，电渗作用使其缓慢向阴极 移动。
等电点
蛋白质是一种两性电解质,它同时具 有游离氨基和羧基。当蛋白质溶液处于 某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的 趋势相等，即成为兼性离子，静电荷为 零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点 （isoelectric point, pI）。蛋白质溶 液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带 负电荷，反之则带正电荷。

小鼠抓取方法
腹腔注射
左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝 上，鼠头略低于尾部，右手持注射器将 针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿 刺，针头刺入皮肤后进针 3mm左右，接着 使注射针头与皮肤呈 45°角刺入腹肌， 穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌 进入腹膜腔后阻力消失，有落空感。固 定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如 无回血、肠液或尿液后即可注射。注射 量为0.1-0.2ml/10g体重。