慢病毒载体的构建讲解

pWXLd : psPAX2 : pMD2G =20:15:6
三 .滴度测定：稀释计数法 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒 数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表
示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天 细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔 板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱
重组酶（Gateway® LR Clonase™ II） 293FT细胞（＜16代） 293FT细胞的培养基及其添加成分（Non-Essential Amino Acids，L-Glutamine，pyeuvate solution and G418） 制备感受态用的试剂
我们用的慢病毒载体的2个包装载体
第三天 追加培养液
在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。 第五天 观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。 假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒
Cytoskeletal anchoring of GLAST determines susceptibility to brain
damage: an identified role for GFAP.
(J Biol Chem,
2007, Oct.)
慢病毒载体介导人IL-12基因修饰树突状细胞体外抗肺癌作用的研究 （邸军，吉林大学博士学位论文，2009年5月）
shRNA : psPAX2 : pMD2G = 20:15:5
Duox1 is the main source of hydrogen peroxide in the rat thyroid cell line
PCCl3
(Exp Cell Res.,2007, Nov. 1 )
人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及重组 (中国普通外科杂志，2008年8月)
必需区，包装成重组病毒颗粒。为了增加病毒载体插入外源DNA的容 量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全 部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。
病毒载体的包装系统，即将外源基因包装到病毒颗粒中，需要： 宿主细胞 病毒复制和包装所必须的顺式作用元件和外源基因的表达盒 辅助元件，即病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件（辅助质粒、 辅助病毒、包装细胞系等）
慢病毒载体的构建

背景知识
病毒载体
是一种常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞，原理 是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。可 发生于完整活体（in vivo）或是细胞培养（in vitro）中。可应用于基础研 究、基因疗法或疫苗。
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
我们用的慢病毒载体表达系统的转移载体
一、空载质粒的验证
包装载体及表达载体质粒的验证
M
MM
A
B
图1 用500ng的pMD2.G、psPAX2、pWPXLd质粒转化Stb13的感受态 菌种，培养后进行小提（图A）并酶切验证（图B）
二、慢病毒载体的包装
病毒包装的实验流程（以6孔板为例）
第一天：293FT铺板（无抗生素；第二天细胞密度达到80%～90%） 第二天：脂质体转染（转移载体+psPAX2+ pMD2.G）
背景知识
病毒载体的纯化： 病毒可以看作是一个具有特定结构的生物大分子。病毒的结构复杂，
纯化时不能采用蛋白质变性和复性的方法，因为一旦病毒蛋白发生变性， 或病毒结构发生破坏，在体外就很难再重建成有感染性的病毒颗粒。因 此，在病毒的纯化过程中必须保持病毒的结构不受破坏，并且监测其感 染活性。
初始物的收集或制备：培养上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物 初始物的浓缩：可选用盐析、超滤、透析等方法进行浓缩。 目标病毒的分离纯化 ：氯化铯密度梯度离心法，柱层析法（亲和层析法）
DNA/RNA DNADNADNA-
DN A
反腺腺单慢
转病伴纯病
录 病 毒 载
毒 载 体
随 病 毒 载
疱 疹 病 毒
毒 载 体
体
体载
体
细胞内包装
裸
阳
蛋白
阳
离
质
离
子
复
脂
合
质
物
复
子 多 聚 物
嵌 合 物
合 物
细胞外包装
背景知识
病毒载体产生的原理： 最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非
中培养。
第二天 加病毒
在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种 病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90µl培养液，往第一个管中加入 10µl病毒原液，混匀后，吸取10µl加入第二个管混匀。依此类推，做
十个稀释度（10~10-8）。 吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。
6-10h换液后开始计时 第三天：转染24h后，转染效率应达到70%以上 第四天：48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤，同时向6孔板中加
入2ml完全培养基；1份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞 第五天：72h再次收获病毒上清，再次感染目的细胞 第六天：一般感染48h后可见荧光
包装质粒的其他参考比例
背景知识
病毒载体的要求： 1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病
类型： 1、重组型病毒载体（可复制型；复制缺陷型） 2、无病毒基因的病毒载体（复制缺陷型）
组成： 1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜
容量： 自身基因组大小的105%~110%
我们现在正在做的病毒载体是复制缺陷型的慢病毒载体（Lentiviral vector），分表达系统和干涉系统 实验基本流程：
构建含有目的基因的转移载体
与2个病毒包装载体共转染293FT细胞
进行病毒的纯化、滴度测定
侵染目的细胞，表达或干涉目的基因
材料：
包装载体：pMD2.G、psPAX2的质粒 表达系统：pWPXLd的质粒 干涉系统：pEN-hH1c、pDSL-hpUGIP的菌种 制备感受态用的Top10、Stb13的菌种