FASP酶解

FASP酶解

一、根据BCA 定量的结果推测出蛋白浓度来计算所需酶解的蛋白量。

二、取所需酶解蛋白提取液到超滤管中，加入400ul, 0.1 mmol/L ，TEAB溶液，注意：

若蛋白液体积过多则可以先离心，条件为14000g，4℃。加入TEAB后溶液，离心14000g,4℃，15-20分钟（时间视蛋白浓度而定，离心至体积只有20ul）,重复三次。

三、在上述蛋白提取液中加入100ul 0.1mol/L TEAB , 之后按照比例加入250ng/ul的

Tripsin y胰酶，适用比例为：细胞蛋白提取液：1:100；组织蛋白提取液：1:50；培养基蛋白提取液：1:50（注：此处比例为蛋白液和胰酶的质量比）。酶解时间为16—18小时，细胞蛋白提取液16小时，组织蛋白提取液18小时，培养基蛋白16个小时。

四、酶解结束后取出先离心：14000g，4℃，15—20 分钟，然后加入10mmol/L TEAB

溶液，反复冲洗吹匀后离心：14000g，4℃，15—20分钟，重复三次，收集所有滤液至新的厚的EP管中，标明后放入离心蒸干机蒸干。

注：1.离心蒸干机在使用之前需要确认冷凝瓶中无液体，如有液体则需要吹干。还需要确认冷凝腔中酒精量是否足够，如果不满，则需要加满。

2.如果蛋白浓度高则离心时间会很长。

3.取出后离心至液体完全滤完为止。