免疫印迹

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SDS－PAGE原理


制胶
★不连续电泳:使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳 浓缩胶(积层胶)的作用:使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先 浓缩成一窄带;便于分离以及得到漂亮的蛋白条带. 分离胶的作用:分离分子量不同的蛋白质亚基(分子筛效应)
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SDS作用
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离 子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链. 当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋 白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来, 而以硫酸根离子外露与水分子作用.
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胶不凝
1）试剂过期：重新配制
2）APS,TEMED过少：加倍 (胶脆，后期操作易碎) 3）配液PH值不对：重新加
4) 环境温度过低：25度左右较好。
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2.上样
具体步骤
样品的处理：30ul小鼠血清＋30ul 2×SDS上样缓冲液，混匀后100℃煮沸 3～5min。 用1×SDS电泳缓冲液加满电泳槽的上下 槽，小心拔出梳子，用移液器将处理过的 样品液加入到孔中，约15-20ul/孔。
3.电泳
电泳具体步骤： 积层胶： 100V
溴酚兰至分离胶与积层胶分界线
分离胶： 120V接通电源 ■溴酚蓝达到胶的底部时，关掉电源，停止电泳。 不应让溴酚蓝泳出底部 ■考马氏亮兰染色，脱色(选做)
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电泳过程中易出现的问题:
缓冲液过稀,跑胶很快,带形很差
SDS浓度过高,结果也不好,因为SDS易引起样品聚集 看不到目的蛋白,可能由于已经跑出胶外:
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+
15
带负电荷的SDS-蛋白复合体
+
16
大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量 为单位), SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不 足道,变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷
因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只
与多肽的大小相关。
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水的作用
压平 隔氧:大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链 长的增加。
①
半干转印法: 凝胶-膜夹层组合放在浸有转移缓
冲液的吸水纸之间．优点：时间少，所需转移 液少．
②
湿转印法: 凝胶-膜夹层组合完全浸入转移缓冲 液中点：转移温和，不会过热，但费时，需较 多的电泳液．
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①
蛋白质从凝胶转印至膜：
湿转印法: 凝胶-膜夹层组合完全浸入转移缓冲
液中点：转移温和，不会过热，但费时，需较
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在转移盒上依次放入以下物品：
NC膜
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浸入式电转印
支持垫 ⊕
NC
凝胶
〇
阳性电极
转印缓冲液
滤纸
尺寸：支持垫＞滤纸＞NC＞凝胶
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2.电转移 具体步骤：
将转移盒放入转移槽中，凝胶面朝向阴极， 接通电源， 冰浴条件下， 100V(200mA)转移2小时。 取出转印膜，准备杂交。
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蛋白质从凝胶转印至膜：
① ②
尼龙:只能结合少量蛋白,优点:机械强度好,不易变形 带正电荷的尼龙(PVDF):通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的 PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用可结合各种蛋白 缺点:因膜表面有大量结合位点,背景差→改变封闭条件 适用：低分子量蛋白
①
重氮化滤纸:能与蛋白共价结合,良好的机械强度.缺点:与许多凝胶电泳系
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样品可能出现的问题:
1.样品加热时间过长,导致蛋白样品出现聚集.100℃,5min 2.样品中含有高离子浓度,导致电泳后蛋白条带变形.
3.为避免蛋白丢失,上样量不要超过泳道体积.
4.上样量过多或电泳前停留过长时间,会导致样品污染临 近泳道. 5.样品处理后,不要放于室温时间过长,以免降解.
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没有滑动加样或未加水
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常见问题
两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?
1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！ 2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多， 凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。
3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合
剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。
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主要内容
一、概述 二、基本原理
三、应用
四、基本流程
五、实验步骤
六、常见问题及解决策略
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基本流程
1.将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离
SDS-PAGE
2.将分离的组分转印到印迹膜
转印
3.对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测 杂交显色
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第一部分：SDS-PAGE
1.制 胶
具体步骤：
1) 将玻璃板洗净擦干(水幕流下) 2) 按下表配制10％的分离胶，充分混匀后沿两板夹 层滑动均匀倒入，距短板上沿3cm左右时停止， 滑动加入少许去离子水覆盖胶面，室温聚合 30～60min。
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分离胶(8 ml)
待分离蛋白质的分子量（KD）
溶液 >50 30～40 20～30 <20 丙稀酰胺/双丙稀酰胺的总百分数 8％ 30：0.8丙稀酰胺/双丙稀酰胺 去离子水 Tris.HCl/SDS pH8.8（4×） 2.13ml 3.87ml 2.00ml 45ul 10％ 2.67ml 3.33ml 2.00ml 100ul 12％ 3.20ml 2.80ml 2.00ml 45ul 15％ 4.00ml 2.00ml 2.00ml 45ul
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印迹膜上总蛋白的染色
用以确定蛋白已经转印到膜上,以及了解转印至
膜上的总蛋白质的组成情况. 用于凝胶染色的常规方法不适用于免疫印迹染 色(背景高) 常用的染料有：氨基黑、印度墨水、丽春红S
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第三部分：抗体杂交及显色
具体步骤：
将转印膜放于封闭液中，4℃封闭过夜。 用洗液洗膜3次，每次5min。 加入用封闭液稀释的针对抗原的特异性抗体（一 抗），摇床上室温振摇反应30～120min。
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样品的制备
★样品缓冲液的配制
SDS:断裂分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和 三级结构. 巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT):使半胱氨酸残基之间的二硫键 断裂.
甘油:比重大
溴酚蓝:指示剂 缓冲液
样品溶于上样缓冲液后,100℃水浴煮沸3-5分钟.
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★蛋白标准的准备 选择合适分子量范围的市售蛋白标准,溶解在上样缓冲液 中,100℃水浴3-5分钟,分装,-20℃可保存六个月. ★样品浓度 1.未知样品:0.1-20mg/ml的稀释系列,以寻找最佳上样浓度 2.考玛斯亮蓝染色:1-2mg/ml 3.高纯度样品:0.5-2mg/ml
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★WB的灵敏度可达到标准的固相放射免疫分析的水 平而又无需对靶蛋白进行放射性标记。
★此方法可检测出1-5ng中等大小的待检蛋白。
4
基本步骤
5
应用
1.检测样品中的蛋白。基于：被测蛋白与抗体的特异性结合 以及蛋白质的相对分子量 2.未知抗原与已知蛋白的关系 3.评价新抗体的特性 4.蛋白质酪氨酸残基是否发生磷酸化 5.不能用于检测蛋白质的生化特性、化学修饰或半寿期
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样品的制备
蛋白质样品的制备
样品处理液还要加入1/4体积左右的上样Buffer， 然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋百度文库变性，方可 作为样品点样。 ★在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注 意其本身浓度，最好是在制作裂解液时就适当稀 释，否则加热后会凝结成固态。
有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂 解的核酸，可以适当离心后再用。
使用预染MARKER
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凝胶电泳—SDS-PAGE
胶厚度的使用低限为0.4mm.较厚的凝胶上加

入较多的样品可提高灵敏度,但厚度必须<2mm.
最大灵敏度获得:胶厚达1.5mm,加大蛋白的上 样量.

长胶可提高蛋白质的分辨率.必要时可让某些
标志物跑出胶,以利于高分子量蛋白的分离.
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SDS-PAGE失败实例及分析
指示剂皱眉(frown effect)
原因:一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 34 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
蛋白样本皱眉
原因:一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净或制胶过 程中中间部分受热不均 35 处理：在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡或重新制胶
指示剂微笑(smile effect)
原因：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于 较厚凝胶。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 36
蛋白样品微笑
原因：电泳过程中受热不 均或有气泡 处理：将电泳缓冲液先冷 却后再用。
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拖尾
(tailling)
原因：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂； 38 电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
5%脱脂奶粉/吐温 5%w/v脱脂奶粉/0.2% Tween20/PBS
Tween 0.2%Tween溶于PBS
价廉 背景清晰
可在抗原检测 后染色 信号强
易变质 可掩饰某些抗原
可能有一些残留 的本底 相对较贵
BSA
3%BSA/PBS
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加抗体注意事项
抗体用封闭液稀释，稀释浓度参照说明书。 抗体孵育过程中，抗体溶液一定要能将膜全部 浸泡覆盖，摇晃孵育才能保证反应完全。 孵育时间：37℃1小时或4 ℃过夜 在保证实验效果的基础上，抗体尽量少加，提 高稀释倍数。 进口抗体在4 ℃保存情况下，短期内可回收使 用1-2次。
统不相容;价格昂贵;活化后半衰期短
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★
转移液
转移液的导电性要尽可能低
甲醇可以提高转移速率
甲醇影响糖蛋白和高分子量蛋白的转移
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常见问题
带上手套，尽量避免污染滤纸和膜
尽量使所有物品保持湿润 夹凝胶时注意，千万不要太用力，凝胶较脆，易碎
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裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，
可以注射器内筒驱除留于膜上的气泡。
用洗液洗膜3次，每次5min。
取出膜，保持膜湿润，DAB显色用蒸馏水或自来水 冲洗，终止反应。
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1.
抗原检测原理
印迹膜上非特异性蛋白结合位点的封闭
非 特 异 结 合 信 号
显色反应
Ag
电 转 膜
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特异性结合信号
显 色 反 应
Ag
封 电
闭 转
液 膜
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常用的封闭液
封闭缓冲液 5%脱脂奶粉 组成 5%w/v脱脂奶粉 溶于PBS中 优点 价廉 背景清晰 缺点 易变质 可掩饰某些抗原 不适于亲和素体系
免疫印迹
(Immunoblot / Western blot)
左大明
zdaming@smu.edu.cn
基础医学院免疫学教研室
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免疫印迹 (immunoblot/westernblot)
又称蛋白质印迹
凝胶电泳和固相免疫测定技术结合
起来的一种免疫生化技术。 借助特异性抗体鉴定抗原
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基本原理
在电场作用下将电泳分离的蛋白由凝胶转 移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测
4) 稍微注意手法，均匀加入。
5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面
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胶为什么总是漏？
1） 每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。
2） 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损，尤其和胶条接触的地方。
3） 关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。 4） 胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。 5） 下面的胶条注意不要老化
多的电泳液．
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①
半干转印法: 凝胶-膜夹层组合放在浸有 转移缓冲液的吸水纸之间．优点：时间少， 所需转移液少．
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浸入式(湿式)电转印
支持垫 NC ⊕ 凝胶
〇
阳性电极
转印缓冲液
滤纸
尺寸：支持垫＞滤纸＞NC膜＞凝胶
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★膜载体:
①
硝酸纤维素膜:在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质 会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起。通常用 0.45μm和0.2μm两种规格，大于20kD的蛋白用0.45μm的膜，小于20kD 的蛋白就要用0.2μm的膜 缺点：结合力弱，易脱落
纹理（streak）
原因：样品中存在不溶颗粒 处理方法：增加溶解度或离心除去不溶颗粒
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上样过多
40
电流过大
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多次加胶
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电泳过早停止
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电泳液被杂蛋白污染了。 配胶的DDW或者缓冲 或者其他试剂被蛋白污染 45 上样太大造成串带
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第二部分：电转移
1.转移芯制备
具体步骤：
戴上手套，在转移缓冲液中操作 量好凝胶样品的大小，将NC膜裁至与胶 同样大小，用转移缓冲液浸泡2分钟。
引发剂 10％过硫酸铵 (APS) 增速剂 四甲基乙二胺 (TEMED)
12ul
12ul
12ul
12ul
加胶至距短板上沿2.5cm,加水至短板上沿
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积层胶
3) 倒去顶层水，用滤纸吸去表面水分，插入梳子。 4) 按下表配制积层胶，混匀后用1ml移液器加入，室温聚合 30min左右。
积层胶（3.9％丙稀酰胺） 30：0.8丙稀酰胺/双丙稀酰胺 Tris.HCl/SDS pH6.8（4×） 去离子水 10％过硫酸铵 TEMED 0.65ml 1.25ml 3.05ml 50ul 10ul