荧光原位杂交技术

硕士学位论文

荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in the

field of environment

作者姓名：**

学科、专业：环境科学与工程

学号：********

指导教师：***

完成日期：2014/3/26

大连理工大学

Dalian University of Technology

摘要

荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。并且展望了FISH技术的未来。

关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测

Abstract

Fluorescence in situ hybridization （FISH）is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.

Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring

目录

摘要 ............................................................................................................................................. I Abstract................................................................................................................................................ I I 1 荧光原位杂交技术简介 .. (4)

1.1 FISH发展历史 (4)

1.2 FISH原理 (5)

1.3 FISH基本过程 (5)

1.3.1 探针制备 (6)

1.3.2 探针的标记 (7)

1.3.3杂交前处理 (7)

1.3.4 杂交 (8)

1.3.5荧光检测与结果分析 (9)

1.4 FISH技术特点 (9)

1.5 常见的技术问题及解决措施 (9)

1.5.1 FISH检测的假阳性 (9)

1.5.2 FISH检测的假阴性 (10)

2 FISH技术在环境领域的应用 (10)

2.1 对硝化细菌的监测 (10)

2.2 对除磷细菌的监测 (11)

2.3 FISH技术在丝状微生物研究中的应用 (11)

2.4 对厌氧颗粒污泥中微生物的监测 (12)

2.5 对自然环境中微生物多样性的监测 (12)

3 未来展望 (13)

参考文献 (14)

1 荧光原位杂交技术简介

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH技术是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。

1.1 FISH发展历史

1986年人们用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行分析，从而建立了荧光原位杂交技术。1988年，Giovannoni等[1]首次将原位杂交技术引入细菌学研究中，使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。然而由于放射性物质对人体有害，加上实验周期长，操作比较繁杂，人们开始研究使用非放射性物质取代同位素来标记探针，如使用生物素和地高辛标记探针，由此建立了非放射性原位杂交技术。1989年，Delong[2]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。从此，人们越来越多地使用荧光原位杂交技术来检测环境中的微生物样品。进入20世纪90年代以后,FISH技术在方法上逐步形成了从单色向多色- FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。多色荧光原位杂交（M- FISH）的最大特点是可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。Cremer等[3]用生物素和汞或氨基乙酰荧光素标记探针建立了双色FISH技术。最近，多种标记的探针和荧光染料可以同时测多个靶序列，最新的多色FISH可同时用7种颜色进行检测。荧光染料具有不同的激发和散射波可以同时检测一个或更多微生物。

FISH技术由于灵敏度高，具有较好的分辨力，实验周期短，操作安全，特别是可以同时分析一种以上的探针，它将成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具，同时FISH技术本身也得到快速发展。