沙门氏菌的检验

沙门氏菌的检验

食品学院 14食品质量与安全1班

刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君

201430520115 201430520116 201430520121 201430520122

摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。

关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定

前言

沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器设备

均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒

恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃

吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头

电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂

1.1.2试剂药品

鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡

1.1.3培养基

蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基

1.2 实验方法

1.2.1培养基的制备

1.2.1.1培养基的配制步骤

蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。分装10瓶，每瓶90ml

四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌 121 ℃，15 min灭菌冷却后至30℃，每100ml 基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml

1.2.1.2配制培养基的注意事项

（1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末；

（2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量；

（3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。

1.2.2 沙门氏菌群检测

1.2.2.1沙门氏菌检测程序

2沙门氏菌检测操作步骤

2.1前增菌

称取 10 g（mL）样品放入盛有 90 mL BPW的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质1 min～2 min，或置于盛有90 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养8 h～18h。

2.2増菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于10mL TTB 内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mL SC内，于36℃±1℃培养18 h～24h。

2.3分离

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。于36℃±1℃分别培养 18 h～24 h（HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或 40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1

2.4生化试验

2.4.1三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。

2.4.2系列生化反应试验

接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18 h～24 h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

2.4.3 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌，如有2项异常为非沙门氏菌。

2.4.4反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

2.4.5 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

2.4.6 必要时按表 5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

2.5血清学鉴定

滴一定生理盐水在载玻片靠近磨砂的一边作对照，在另外一边滴一滴血清，用灭菌后的接种环从三糖铁琼脂培养基的斜面取一点菌种，放进血清中，然后用酒精灯将接种环灭菌冷却后，再取少量菌种放进生理盐水中。观察血清中的的菌落是否凝结，与生理盐水中的菌落对比。

2.6结果与报告