静脉注射免疫球蛋白的病毒安全性概况

静脉注射免疫球蛋白的病毒安全性概况

黄丽花

(广西百色市卫生防疫站,广西百色533000)

【关键词】　免疫球蛋白;非甲非乙型肝炎;丙型肝炎病毒;乙型肝炎病毒;病毒安全性

文章编号:1003-1383(2004)03-0284-03 中图分类号:R446.62 文献标识码:A

静脉注射免疫球蛋白(IV IG)作为治疗各种自身免疫病、原发性体液免疫缺陷症、防治获得性免疫缺陷者细菌和病毒感染的有效手段,已为国内外许多临床工作研究者证实,并将IV IG归纳为6个治疗领域。然而,随着Lane1对输注IV IG后发生非甲非乙肝炎传播的首次报道后,多个国家多个制造厂家的数批IV IG输注后引发上千例非甲非乙肝炎传播也相继报道,IV IG的病毒安全性问题引起了人们的关注。研究人员发现,IV IG传播病毒性疾病可能与IV IG的分离纯化工艺;原料血浆的病毒性抗原、抗体筛选;IV IG生产工艺中病毒灭活工艺的加入及灭活方法的选择等密切相关。

可经血与血液制品传播的病毒

1.丙型肝炎病毒　Y ap2报道10多年时间来发生IV IG 输注后传播HCV的几种IV IG制剂中包括试验产品和正式产品。首次由Lane1报道的是英国Herts血液制品实验室(BPL)的一批试验IV IG,它采用低温乙醇分离后加入Sephadex2G25凝胶过滤纯化,最终加入人血白蛋白作为稳定剂后冻干而成,该批试验IV IG具有较强的感染性,在临床使用中接受输注的12人均发生了非甲非乙肝炎的感染3;随后Baxter中试工厂生产的两批试验IV IG4和瑞典K abi公司生产上市的IV IG产品G ammonativ5,均采用低温乙醇分离加DEAE2Sephadex凝胶过滤纯化,也有输注者发生非甲非乙肝炎感染事件。上述产品尽管在回顾性调查中均未找到发生输注后非甲非乙肝炎传播的确切原因,但是很明确的一点是产品在生产中均未加入特定的病毒灭活步骤。其次是由苏格兰国家输血机构(SNB TS)采用低温乙醇分离加低p H和酶处理生产的一批IV IG,输注者中同样发生了非甲非乙肝炎感染的病例6,根据推测其原因可能与生产过程中执行GMP的失败有关。IV IG中发生HCV传播例数最多的产品是东德7和以色列输血协会(B TSB)8生产的抗2D IV IG,由于高效价的抗2D血浆来源短缺,两者均采用了收获率较高的分离方法(采用离子交换柱层析替代低温乙醇分离的方法)进行小规模的特异免疫血浆的分离。回顾性调查已证实,在为数较少的抗2D免疫血浆的供血者中有个别发生过急性HCV感染,其中东德的两名供血者因接受了HCV感染的Rh 阳性红细胞免疫而致HCV,在以色列的供血者中一例也发生过HCV感染。未经筛选的HCV感染血浆导致小规模混合血浆的HCV含量较高,而分离过程又不足以灭活和去除其中HCV,加上在生产工艺中未加入特定病毒灭活步骤,由此导致多批污染制品在上千例接受者中发生多例的HCV感染。十多年时间的跟踪调查证实两种抗2D IV IG均使接受输注者中大约60%的病人发生HCV感染9,事实表明分离工艺的选择对于原料血浆中病毒的去除和灭活具有非常重要的意义。IV IG输注后发生HCV传播引起了研究者的高度重视,各国血液制品生产厂家开始对原料血浆进行抗2HCV 筛选,采取这一措施的确对降低原料血浆中HCV负载起到了重要作用,但是抗2HCV筛选是否会去除血浆中HCV的特异性中和抗体,一直是受到关注和争论的问题,有研究发现, HCV外膜蛋白的抗体通过封闭HCV的吸附对其产生一定的中和作用,从而使HCV在IV IG分离过程中被去除,但是由于HCV RNA的高变异性,使这种中和抗体在临床上不能显示其对HCV感染的有效保护10。有报道认为原料血浆中抗2HCV的去除,可能改变在IV IG分离过程中HCV在各组分中分布特性11,对分离过程中HCV的去除产生一定影响。抗2HCV筛选毕竟不是HCV病原学检测,但随着HCV2 RNA检测工作的进展,相信不久的将来在供血者中采用更为灵敏、特异和快速的HCV2RNA检测将会变成现实。

2.人类细小病毒B19　人类细小病毒B19可污染血浆和血液制品而引起慢性病毒血症、再生障碍性贫血等疾病。由于该病毒为非脂包膜病毒,具有耐热、抗理化处理的特性,因此目前尚无稳定可靠的方法对其灭活,并有经凝血因子传播B19病毒感染的报道。采用PCR检测免疫球蛋白时发现,在经SD灭活处理的IV IG中的B19病毒DNA阳性率较高,而在经低p H处理、酶处理和巴氏消毒处理的IV IG中则未检出该病毒12。尽管如此,目前尚无资料表明PCR检测阳性的IV IG具有感染性。中和性抗2B19抗体可阻止病毒与细胞的结合,但是否具有对B19病毒感染的保护作用尚不清楚。有资料报道IV IG的分离过程对B19病毒具有去除作用,但不同工艺对该病毒的去除有较大差异13。尽管到目前为止经输注IV IG致病毒感染尚未见临床报道,但在IV IG制品中检出B19病毒DNA的情况已受到人们的关注。因此建立原料血浆中B19病毒的筛选方法以及采用适宜的病毒灭活工艺对于提高IV IG的安全性具有十分重要的意义。

3.甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及巨细胞病毒(CMV)　①HAV属非脂包膜病毒,SD方法不能对其有效灭活,曾有报道经SD灭活的

作者简介:黄丽花(1966-),女,广西田阳县人,主管技师。

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凝血因子后发生HAV的传播,但有关经IV IG传播HAV的情况尚未见有报道。抗2HAV中和抗体对HAV具有非常有效的灭活作用,因而对阻止HAV传播起到较积极作用14。

②自对原料血浆进行HBsAg的筛选以来,尚未有经IV IG传播HBV的报道,加上目前对用于血液制品生产的供血者在采血浆前均进行HBV疫苗的免疫接种,因此原料血浆HB2 sAg筛选及特异性中和抗体有效阻止了IV IG制品HBV的传播。③由于HIV是一种对理化因素影响耐受较差的病毒,一般在分离过程中即被灭活,此外目前在供血者中常规进行抗2 HIV筛选,也尚无经IV IG输注后发生HIV传播的报道。④已知CMV的传播大多发生在输全血或成分输血的情况下,去除白细胞的血液或血液制品一般不会发生CMV的传播。无论血浆或血液制品中的CMV均可被抗2CMV中和而失去感染性。可以认为CMV目前尚不构成IV IG输注后发生传播的危险。

免疫球蛋白病毒安全性的保证措施

1.筛选献血者　①采用第3代高灵敏度抗2HCV试剂盒,筛除抗2HCV阳性者毫无疑问,但对“窗口期”的血浆仍不安全。“窗口期”血浆不但病毒滴度高(108拷贝/ml),而且HCV和抗体形成的免疫复合物仍有传染性。加上方法学的差异、试验条件控制不当、实验误差等,使混合血浆污染HCV,也查不出所有抗2HCV阳性的血浆。另外第3代抗2 HCV试剂均根据HCV21型一个基因型衍生和HCV23型有共同基因,因HCV有三个基因型,故漏检难免;②对献血者进行抗2HIV筛查,混合血浆中污染HIV的危险性极低,而且近年来窗口期污染的血浆不断下降,美国Lackritz等计算为1/3.6×10615。

2.IV IG生产过程除去病毒　排除病毒主要有两种方式即组分分割作用和灭活。①分割作用:1978年Trepo等证实应用Cohn’s组分法,病毒颗粒与废弃组分一起沉淀或澄清过滤时被吸附。而HBV分割FⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,FⅡ组分中则没有16。1985年Piskiewiez等证实采用此法,HIV21的20% (V/V)很快被灭活17。1986年Mitra等报告Cohn’s组分血浆到FⅡ时,HIV降低>1015TCID50/ml18。Henin等也证实K istler2Nitichmann组分法能除去HIV2119。②灭活病毒:有效灭活病毒工艺必须保证提纯蛋白的结构和功效的完整性。常见的灭活病毒的方法有抗体介导中和病毒、p H4.0或p H 4.25处理、β丙内脂/UV照射、有机溶剂/清洗剂、巴斯德灭活、纳米过滤等。灭活效果应加以验证原料混合浆或半成品中是否加入已知量指示病毒,灭活处理后应再检测病毒的滴度,或采用动物试验。

3.灭活病毒效果验证　①指示病毒:包括相关病毒和模型病毒。相关病毒已知血液传播能在体外培养,目前,国内外均选用HIV21型作为模型;模型病毒如HCV体外尚不能培养,可作为经典的选择模型,先用BVDV或猪霍乱病毒,以及外衣病毒Sindbis、Semlikiforest病毒。②灭活效果的验证:动物试验(黑猩猩)或病毒体外培养进行滴度的测定(TCID50,PFU)。③灭活效果的确认:通过灭活处理检不出加入的指示病毒或灭活6个数量级以上的指示病毒量。1994年德国Paul2Ehrlish研究所定量灭活病毒规定的指标,脂膜病毒降低10log;非脂膜病毒降低6log。两步法中,每一步要降低脂膜病毒>4log,且必须提供灭活非脂包膜病毒的警戒值。但对这个规定尚有争议。

4.进一步增进IV IG病毒安全性探索　①PCR检测:混合血浆中抗HIV、抗HBV经稀释100～10000倍后酶标检测法仍能检出,但抗2HCV不能,HCV RNA混浆中比成品中高。血清恢复期前HCV负荷量按bDNA法检测为2.9×107gEq/ ml,稀释5000倍仍然检出4000gEq/ml20。PCR筛检成品IV IG作用不清楚,对混合血浆非常重要,尤其不能完全排除感染HCV的“窗口期”献血者。欧洲质控部门建议混合血浆(90～150份)检测PCR HCV RNA。美国FDA要求IV IG常规检测PCR HCV RNA,并作为批发放的标准。但提请注意,血制品会出现PCR阳性却没有传染性的可能。因为传染性不仅依据RNA、DNA,而且病毒的酶和蛋白在传染过程中可能是重要的。血制品在制造过程中采用灭活病毒工艺,可使这些病毒的酶和蛋白变性,而不影响PCR的结果21。②多步灭活病毒:为扩大灭活病毒的范围和数量,采取两步灭活以增加IV IG的安全性。但两种灭活的方法要对不同的病毒谱发挥作用。如S/D和低p H孵放灭活病毒谱相同,不存在增加IV IG病毒安全性。③体外传染性的检测:血制品病毒安全性可依赖体外检测。目前HCV仅有灵长类黑猩猩动物试验可以利用。HIV灭活效果体外试验很有帮助。现有许多研究可以培养出HCV,即使感染水平很低,也可以补充PCR HCV RNA和HCV模型病毒的研究。

总之,在不断提高献血者合格标准;IV IG经低温乙醇组分的分割作用;采取高效灭活病毒工艺等处理,IV IG病毒安全性是有保障的。

参考文献

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右江医学2004年第32卷第3期