发酵工艺实验

实验一柠檬酸发酵

1、实验目的了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。

2、实验原理

黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径(EMP)和HMP途径转变为丙酮酸;丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为

C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O柠檬酸理论得率为106.7%;若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。

3、实验装置与流程

(I)实验装置与材料:

A、实验装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机(4000-6500r/min) 。

B、菌种:黑曲霉柠檬酸生产菌株Co8-27。

C、材料：麸皮，马铃薯,薯干淀粉,蔗糖,玉米粉,大麦芽，大米,琼脂,淀粉酶(中温酶与高温酶)。

D、器皿：15mL试管，100mL三角瓶，2000mL烧杯,500mL三角瓶,离心管若干。

E、试剂:0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，费林甲，乙溶液，0.01%标准葡萄糖溶液。

(II)实验流程:

保藏菌株→活化菌株(斜面培养)→200mL三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。

(III)斜面培养基:

马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g切成小块,加水约500mL,煮沸30min，然后用纱布过滤,滤液加蔗糖20g，琼脂20g，溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121C灭菌20min，取出摆成斜面备用。

摇瓶发酵培养基：取细度为40目以上的淀粉6~8g，装入500mL三角瓶中,再加入物40mL水和5个单位淀粉酶(中温)/g淀粉,于75-80'C下液化15min。瓶口塞入8层纱布包扎好,于1l0'C灭菌15~20min,冷却备用。取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中,加入1000mL水和7--8个单位a-淀粉酶(高温)/g玉米粉,80’C液化10min后,继续加热至90C保温30min,碘检不变色后，再加热到100℃煮沸(5~10min),趁热经过二层纱布过滤,加水冷却并调整糖度至15%~20%和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤液40mL分别装入500mL三角瓶中,瓶口塞入8层纱布包扎好，于121‘C灭菌15-20min冷却备用。

4、实验步骤及方法

(1)种子制备:

(A)斜面种子制备:

用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种于斜面培养基上, 于35'C恒温箱中培养3~5d,待长满大量孢子后,即内活化的斜面种子。(B)孢子悬浮液的制备: 用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上,用接种环轻轻刮下孢子,装入含有玻璃球

的三角瓶,盖好塞子振荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接2~3瓶麸曲三角瓶。

(2)摇瓶发酵培养:

将麸曲孢子(或直接将斜面种子)于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。接种量：一支斜面接4~5瓶,一瓶麸曲孢子接20-35瓶。500mL三角瓶装液40mL,于转速为200r/min(24h前为100r/min,24h后为200r/min)、300r/min(24h前为100r/min,24h后为300r/min)旋转摇床上,350C下培养3-4d。

(3)发酵过程检测:

（A)发酵0、24、48、72、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量,以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。

反应条件:24h前为100r/min,24h后为200r/min。

（B）柠檬酸含量检测:一般检测发酵过程中的总酸,采用0.1429mol/LNaOH溶液滴定发酵过滤清液。

（C）总糖及残糖(还原糖)测定:采用费林试剂法。

5、实验结果与记录表

5 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵

发酵时间/h 残糖/% 柠檬酸(总酸)含量/% 糖酸转化率/% 0 瓶1

瓶2

24 瓶1

瓶2

48 瓶1

瓶2

72 瓶1

瓶2

反应条件:24h前为100/min,24h后为300r/min

6、实验数据处理

(1)平均耗糖速率(g/h):单位时间内黑曲霉消耗糖(还糖)的克数。

(2)平均柠檬酸生成速率(g/h):单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。

(3)糖酸转化率(%):黑曲霉生成拧橡酸的克数与消耗(还原糖)的克数之比的百分数。

7、思考题

(1)试以发酵时间为横坐标,以糖消耗量、柠檬酸生成糖酸转化率为纵坐标作图,说明三者随发酵时间的变化,并加以分析。

实验二、抗生素发酵实验

1、实验目的

通过添加抑制剂的方法,加深对抗生素代谢调控发酵的理解,掌握抗生素研究中常用的比色、纸层析等实验技术。

2、实验原理

四环素族抗菌素包括金霉素、四环素和土霉素。它们的化学结构极为相似。

R1 R2

金霉素Cl H

土霉素H OH

四环素H H

因为金霉素比四环素只多一个氯离子,所以只要在发酵加入能够阻止氯离子进入四环素分子的物质,从而使菌种产多的四环素。本实验中,利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制作用的原理,通过加入硫醇苯噻唑(即M-促进剂)抑制氯化酶的作用,增加四环素的产量。实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。四环素和金霉素在酸性条件下,加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素,其色度与含量成正比。碱性条件下,四环素较稳定,金霉素会生成无色的异金霉素。

根据上述原理,可以在酸性条件下,利用比色法测定四环素需求混合液的总效价,而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素,然后再在酸性条件下，使四环素生成黄色的脱水四环素,经比色测得四环素效价。总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。

发酵液中加入乙二胶四乙酸二钠盐(EDTA)作为螯合剂,掩饰金属离子的干扰,改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少发酵液中所含杂质对比色反应的干扰。

3、实验仪器与材料

250mL三角瓶(x12个),500mL三角瓶(x 48个),50mL容量瓶，1mL、5mL和10mL 吸管,粗口吸管,新华1号滤纸,层析缸，比色计等。孢子培养基(g/L)：小麦麸皮35,琼脂20,合成水[MgSO40.1，KH2PO40.2,(NH4)2HPO40.3],蒸馏水配制,自然，pH。种子培养基(g/L):黄豆饼粉20，淀粉40、酵母粉5,蛋白胨(NH4)2SO43,MgSO40.25, KH2PO40.2,CaCO34。发酵培养基(g/L):黄豆饼粉40,淀粉100，酵母粉2.5,蛋白胨15，(NH4)2SO43，MgSO40.25，CaCO35，a-淀粉酶活力为105u/mL0.1mL。草酸，