六味地黄丸的血清药物化学研究

经与六味地黄丸、 空白血清及单味生药比较 分析确定入血成分的来源为： ! 号峰的归属较为复 杂， 来源于三种生药。首先， 熟地中含有此成分， 此成分在六味地黄丸和熟地中含量均很低， 但是 吸收入血后此成分的相对含量大大提高， 表明复 方配伍后其有较强的血中转移能力 （图 -） ； 其次， 在除去熟地的样品给药后， 血清中仍然出现 ! 号 峰， 表明其他药材在体内对 ! 号峰的产生也有贡 献； 山茱萸和泽泻中虽不含有此成分， 但给药后血 中也能产生该峰 （图略） ， 经光谱分析表明与六味 地黄丸血清中的 ! 号峰为同一成分， 所以推测山
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清药物化学研究。 六味地黄丸出自宋朝钱乙 《小儿药证直诀》 ， 是 “滋阴补肾” 之首方， 现临床上广泛用于多种疾 病的治疗。目前， 对六味地黄丸的成分及药效研 究较多， 但有关的成分研究大多只限于成分的定 性、 定量的分析， 针对药效物质基础的研究很少； 有关药效的研究也多只集中 在 免 疫 调 节 作 用 方 面。六味地黄丸在体内以何种成分、 何种形式发 挥作用以及作用机理如何， 至今少有明确的研究 报道。因此， 有必要对六味地黄丸的血中移行成 分进行详细的分析， 阐明其血中移行成分、 代谢产 物及方剂的配伍意义， 从而有的放矢地改善其生 产工艺， 提高制备水平， 提高临床疗效。
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收入血后， 其代谢产物量较大， 具有产生药效的可 能性， 或许具有更强的生理活性。从 !、 "、 #、 $ 号峰
的保留时间和 %& 光谱推测可能为丹皮酚的脱甲 氧基代谢物、 葡萄糖醛酸或胆汁酸的结合体。
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醇定容为 !" #$， 溶液过 "%&’ ! 另 # 微孔滤膜即得； 分别置于 精密称取丹皮酚及马钱素对照品 ! #(， 加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得 !" #$ 容量瓶中， 丹皮 酚 及 马 钱 素 对 照 品 溶 液； 上述各样品液供 )*+, 分析使用。 -%- 空白血清及含药血清样品的制备 取 ./0123 大 鼠， 禁 食 !- 4 （ 自 由 饮 水） ， 按照 分别灌胃给予蒸馏水、 六味地 !%’ #$ 5 !"" ( 体重， 黄丸、 缺味六味地黄丸及单味丸的甲醇提取物的 混悬液， 给药 6" #/7 后用 !8 戊巴妥钠麻醉， 经肝 门静脉取血 ’ #$， 血液在 9 """ 3 5 #/7 条件下离心 取上清液 ! #$， 加入 "%- #$ :"8 高氯酸， 快 !" #/7， 速摇匀， 条件下离心 ， 取上清液 9 """ 3 5 #/7 !" #/7 过 "%&’ ! 备 )*+, 分析。 # 微孔滤膜， -%9 )*+, 分析色谱条件 （9%A ## B .21;3 <=##;13= <4/;$> ?*!@ 色谱柱 ； 柱 !’" ##， ’! #） CDE2F*2G ,!@ HI23>F*2G 保护柱； 温 9" J ； 流速为 ! #$ 5 #/7； 检测波长 -"" K &"" 7#
【收稿日期】 !""#$"#$"% 【基金项目】 国家留学归国人员科研基金 【获奖项目】 !""! 年国家科技进步二等奖 【! 通讯作者】 王喜军： 教授， 博士生导师， 黑龙江中医药大学副 校长。 &’(： %)$#*+$%!++"%+%， ,$-./(： 0/12345 6/3.7 89!""# 年 > 月 万方数据 第!卷 第#期
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按药典六味地黄丸处方称取药材， 采用 !""" 年版药典方法分别制成六味地黄丸、 缺味六味地 用 +" -( 甲醇超声提取 黄丸及单味丸， 各称取 + S， （! 次） ， 滤过， 合并滤液， 滤液干燥后加入甲 +* -/3
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茱萸和泽泻中所含的物质被代谢后共同产生该成 分。可见， 复方中三种生药对血中同一成分 ! 号 峰有共同贡献， 表明熟地配伍山茱萸和泽泻的必 要性及复方配伍的科学性。 -、 &、 ’、 !" 号峰为山茱萸所含成分直接入血而 形成， 经与标准物质对照表明 ’ 号峰为来源于山 茱萸的马钱素； : 和 !! 号峰为牡丹皮中所含成分 直接入血而形成 （图 9） ， 经与标准物质对照表明 !! 号峰为来源于牡丹皮中的丹皮酚； 9、 6、 @、 A 号峰为 丹皮酚的代谢产物 （图 &， 图 ’） 。所以， 血清样品 中丹皮酚峰较体外样品中明显下降。丹皮酚被吸
（ D.E’F6 )"" =93EF9((’F， D.E’F6 高效液相色谱仪 D.E’F6 )"" ;2-G， D.E’F6 @@) ;H9E9I/9I’ CFF.J K’E’8$ ； （A7@ -- M +*" E9F） D.E’F LJ--’EFJ LH/’(I =+% 色谱柱 ； *! -） N9O.$;.P =+% Q2.FI$;.P 保护柱； %"$! 型 --， 离心机； :))R= 型 超 声 震 荡 仪； 6P$+ 型 快 速 混 匀 器。 +7! 药品和试剂 对照品 （中国生物制品药品 丹皮酚 （ ;.’939(） 检定所提供） ； 马钱素 （ <9S.3/3） 对照品 （南京中医 药大学提供） ； 熟地黄、 山茱萸、 牡 丹 皮、 山 药、 茯 苓、 泽泻 （均购于哈尔滨市人民药店， 经鉴定为正 试剂公司） ； 品） ； 乙腈， 色谱级 （美国迪马 （ K/P-.） 其余试剂为分析纯。 +7A 动 物 健康 D/6E.F 大鼠， 体重为 !"" T !" S， 雌 ) 周龄， 雄不限， 黑龙江中医药大学实验动物中心提供。 " 实验方法 六味地黄丸供试品溶液的制备
六味地黄丸的血清药物化学研究
王喜军+! ， 张 宁， 孙 晖， 孙文军
黑龙江中医药大学药学院， 哈尔滨 +*""#" 【摘 要】 目的： 对六味地黄丸的血清药物化学进行研究。方法： 建立六味地黄丸及口服六味地黄丸后大
鼠血清的 :;<= 指纹色谱分析方法； 分析比较六味地黄丸、 缺味处方、 单味生药以及各组分给药后所得血清样 品， 鉴定口服六味地黄丸后大鼠血中移行成分、 来源生药及其代谢产物。结果： 口服六味地黄丸后从血中发现 了 ++ 个入血成分， 其中 # 个为新产生的代谢产物； 其中有一成分虽为 > 个成分为六味地黄丸所含成分的原型， 地黄中所含成分的原型， 但其它两种药材也能代谢产生， 对其体内的量变有共同的贡献。结论： 血中移行成分 及代谢产物将成为六味地黄丸的体内直接作用物质， 其来源生药为六味地黄丸的主要药物， 对其进行深入的研 究， 将有助于阐明六味地黄丸的有效成分及作用机理。 【关键词】 六味地黄丸； 血清药物化学； 代谢产物； 指纹图谱 【中图分类号】 ?@A+ B >+， ?@+> 【文献标识码】 C 【文章编号】 +)>!$A)*+ （!""#） "#$"!+@$"#
9%! 六味地黄丸给药后血中出现了 !! 个移行成 分 （图 !） ， 与体外样品比较， 其中七个为体外成分 直接吸收入血， 即 !、 -、 &、 ’、 :、 !"、 !! 号峰为六味地 黄丸中所含的原型成分， 且 ! 号峰转运入血后的 相对含量有较大的提高， 而 !! 号峰却明显下降； 9、 6、 @ 及 A 号峰为新产生的代谢产物。
中药血清药物化学是以传统药物化学方法为 基础， 综合应用多种现代技术， 分析鉴定口服中药 后血清中移行成分， 研究其药效相关性， 确定中药 药效物质基础的应用学科
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实验材料 仪 器
。应用本方法已经成
功地完成了茵陈蒿汤的生物药学研究， 首次阐明
［!， A］ 了该复方的作用机理 ； 进行了地黄血清药物化 ［#］ 学的初步研究 。本实验进行了六味地黄丸的血
扫描； 流 动 相 乙 腈F"%!’8 磷 酸 梯 度 洗 脱： " 5 !""
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!!- 5 @@ !9" 5 :"。 六味地黄丸及其血清中成分的分析
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以及 ’ 批六 取 !" 批六味地黄丸供试品溶液， 味地 黄 丸 血 清 样 品 在 相 同 的 色 谱 条 件 下 进 行 建立 )*+, 色谱图， 并比较分析确定进 )*+, 分析， 入血液的成分。并通过缺味六味地黄丸及单味丸 及其血清样品的分析测定， 对相应的色谱图进行 比较分析， 确定入血成分的来源药物。 ! 结果与讨论