微生物单宁酶与植物单宁知识介绍

微生物单宁酶与植物单宁知识介绍
微生物单宁酶是同“植物单宁”一类生物活性有机化合物的“新家族”这一与时俱进的新概念提出密切相关。

伴随着植物和微生物生物学的迅猛发展，对植物单宁（同义语：植物多酚，鞣质）这一古老而又现代的复杂天然有机化合物的神秘面纱正在逐步揭开，旧有的知识概念正在柀修订，植物单宁生物化学，分子细胞生物学前沿科技领域不断推出的新研究成果，反过来又给传统的应用领域带来创新机遇，影响最直接的莫过于食品药品保健品等工业生物技术领域。

植物单宁，俗称鞣质，或植物多酚(plant polyphenols),表明该天然产物化学结构的多样性，反应的多重性，分子量在500~3,000之间，或者更高的生物大（中）分子物质。

这类化合物已经给公衆键康施加了重大的影响，其生物活性成分主要功能有止血，抗氧化，抗病毒，促进氮代谢，改善肾功能，以及精神病治疗，故称植物单宁为天然有机化合物的新家族。

国际上统一将单宁的化学结构分为可水解单宁（hydrolyzable tannins）和缩合单宁(condensed tannins)。

前者母核为葡萄糖或多羟基化合物如儿茶素的没食子或并没食子酸酯的多聚物。

新近有关可水解单宁生物合成形成和沉积位点在叶肉细胞壁这一主要场所，这已为酶学—免疫组织化学实験证据所证实；这与早期报告的“单宁液泡说”不同。

因此，现在可以把单宁液泡内容物看作本质未定的多酚化合物，由于使用非特异性显色反应检测法所致。

缩合单宁，如称为原花色素（proanthocyanidins），大多数发现在飼料豆科植物中，但是它的生物合成仍是不确定性的[6]。

可水解单宁物质在水相介质存在酸、碱、以及生物催化剂—单宁酶或加热时易水解为酚酸、糖或多元醇酸。

例如，真菌单宁酶（EC 3.1.1.20）可以在温和的生理水相反应介质体系中直接酶水解单宁底物的缩酚键、酯键，积累显著数量的小分子优势产物沒食子酸（GA），以及其它化合物，如五倍子单宁的葡萄糖，塔拉单宁的奎尼酸等。

单宁酶主要耒源于微生物，属水解酶类（EC 3.1.1.20），主要集中分布在曲霉属（Aspergillus）菌种，另外青霉、酵母、细菌，以及植物和动物，如山羊的胃粘液中也存在活性单宁酶，它具有均能促进单宁的水解。

已经报道的产单宁酶微生物菌种有黑曲霉（Asp。

niger），它具有工业应用安全性好（GRAS）的特点。

本实验室分离选育的黑曲霉（Asp.niger）CIB 13-1337菌株，在使用五倍子单宁诱导搖床培养产生的单宁酶液体培养物，经由硫酸胺分级沉淀，
EDTA-Sepharose离子交換层析、Sephadex G-150凝胶过滤，从该菌株的发酵液和菌丝体中分离纯化得到凝胶电泳均一单宁酶条带的分析结果：该酶作用的最适温度为30℃，最适pH值5.5；在温度10~30℃，pH4~6之间保持稳定。

金属离子对单宁酶没有明显的激活作用，Fe2+和Mn2+则对酶有抑制作用。

纯化酶样品经SDS-PAGE测分子量为5.8 KD，其等电点为pH4.1。

借助海藻酸钙凝胶包埋法，制成固定化单宁酶酶制剂,批式酶法水解五倍子单宁制GA，连续使用3次制备试験，GA净产率61%；且固定化单宁酶经连续多次使用，转化能力未见明显下降，说明该固定化酶稳定性较好。

使用该菌种生长培养好的整菌丝在2L自动控制玻离发酵罐转化制备GA,可连续使用7次，生物催化活力不减；车间放大试験到500L发酵罐规模，批式生物转化五倍子单宁公斤级水平制GA，在分批添加底物总量达8~10%质量浓度（w/v）,可定量转化底物为GA，发酵液GA积累浓度达到55.0~70.0g/L,回收的粗品产物GA经大孔吸附树脂柱层析精制，GA净回收率90%
有关黑曲霉单宁酶的其它结构特征，包括分子中氮含量为12.9%（凯氏定氮法），用二硝基氟苯法测氨基末端，有2个DNP-氨基酸产物，分别为DNP-Ala 与DNP-Arg，该结果证实黄曲霉单宁酶为2个亚基组成。

另外一个显著特征是该酶蛋白为糖蛋白；且不同来源的单宁酶分子糖含量有差异，例如黑曲霉中提取的单宁酶糖基含量高达43%，酵母单宁酶为62%；选育的黑曲霉单宁酶糖链部分糖基组成为葡萄糖和甘露糖，糖含量12.3%；蛋白质含量为72.5%，肽链通过Ser 和Thr与糖基连接，糖基与酶的功能关系尚未見报道。

丝状真菌作为重要的工业菌种，近年来已经在30多种真菌中建立起了DNA 转化系统，具有很强的蛋白分泌能力，能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，糖基化方式与高等真核生物相似。

对于黑曲霉单宁酶的分子生物学研究国外也已经着手进行，对其基因表达调控方面重组菌产生单宁酶进行了实验研究，证明指导单宁酶生物合成的mRNA极不稳定，放线菌酮可迅速阻止单宁酶的产生。

虽然丝状真菌的基因操作相对较新，但近年来该技术进展较快，现已有来自Asp. oryzae和Asp.niger var. awamori的数十个基因被克隆及测序。

国内，
黄日波等也首次开展了单宁酶基因在黑曲霉ST31中的克隆与表达，该研究从米曲霉克隆单宁酶基因，构建单宁酶基因穿梭表达载体ANEP2-SP2—tan,然后通过原生质转化法导入黑曲霉ST31中进行表达，结果表明重组菌株的单宁酶活力为104.02U/ml发酵液，比原始出发菌株米曲霉提高2~3倍。

国外，特别是80年代以来，日美德等国家对植物单宁/微生物单宁酶的基础理论和应用研究已取得长足进展，并已经在茶饮业得到实际应用，获得较好的经济效益。

国内，近年来作者实験室针对我国特产五倍子单宁生物资源及微生物单宁酶酶法加工生产GA的生物化工新工艺，已有鉴定了的阶段放大实験成果。

加之，过去十年开展以黑曲霉为代表的微生物单宁酶SSF制酶曲及采用生物催化与生物加工过程的实験研究工作，已应用于滇橄榄果的果汁澄清，均都已经在攀枝花宇森酒业公司得到初步应用，成效显著。

在实验室制备作结构测定用的单宁酶酶制剂时，黑曲霉菌种接种培养在产酶液体培养基中，26~28℃，振荡培养2~2.5日，在未出现黑色孢子前，过滤分离菌丝；收获的白色菌丝体经匀化器破碎、超声波处理，于0~4℃离心分离，除去沉渣；上清液经40℃旋转蒸发，减压浓缩到1/5液量体积，再次低温离心，所得上清液直接置于-20℃冻干处理，或用5倍量冷甲醇沉淀，离心，干燥，制得的浅灰色粉末即是单宁酶酶制剂。

它可用于没食子单宁作底物的酶水解反应，制得唯一的酚性组份终产物GA。

该酶制剂可作为植物化学成份结构鉴定用。

院地合作“滇橄榄汁（酒）微生物酶法加工新技术”通过鉴定
成都分院
由中科院成都生物研究所和攀枝花宇森酒业有限责任公司共同完成的攀枝花市——中国科学院科技成果孵化资金项目“滇橄榄汁(酒)微生物酶法加工新技术”近日在成都通过了中国科学院成都分院组织的专家鉴定会。

鉴定委员会专家认真听取了课题组作的研制工作报告和技术报告，审阅了有关资料，观看并品尝了样品，经认真讨论，对项目取得的成果给予了充分肯定，认为该项研究立足我国亚热带地区丰富的滇橄榄(余甘子)野生植物资源开发过程中遇到的难题——果汁(酒)加工中制品的沉淀问题，应用食品安全性好的黑曲霉纯培养物作生物催化剂，建立了酶法加工滇橄榄汁(酒)的技术路线，为国内进行滇橄榄生产加工技术开发提供了新的途径。

专家们指出，利用微生物酶法加工技术，改进滇橄榄汁(酒)的稳定性，具有一定创新性，在国内同类研究中处于领先水平。

两年来，课题组针对滇橄榄果水溶性提取物干粉制剂高单宁含量(55%)的特征，利用现代分析检测技
术、定向诱导培养发酵的直接筛选程序，选择出高单宁酶活性的菌种——黑曲霉作为酶源菌株，对滇橄榄汁(酒)酶法加工的反应条件、优化处理工艺参数等进行了实验研究，完成了实验室规模的液体/固体黑曲霉纯培养物对滇橄榄汁(酒)的多批次处理试验。

优选出了较佳处理方案，并进行了重现性试验，贮存稳定性考察时间达7个月以上，较好地解决了滇橄榄汁(酒)的沉淀问题。

研究中，课题组选用黑曲霉单宁酶固体培养方法，制备出公斤级固体单宁酶曲并已稳定应用于企业车间的放大试验，研制的样品在稳定性、口感及澄清度等技术经济指标方面符合企业标准。

同时，他们还将该酶曲用于滇橄榄渣的处理，可提高出汁率15%以上，减少了废渣废水的排放。

目前，企业已开始进行单宁酶酶法加工滇橄榄新技术的工程化技术改造。

“滇橄榄汁(酒)微生物酶法加工新技术”的研制成功，不仅为规模化开发滇橄榄资源找到了一条技术经济可行的生物转化路线，同时也为所企合作提供了示范，为研究所科技成果转化开辟了新渠道
第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集
会议论文
黑曲霉单宁酶酶法水解制取没食子酸的研
究
杨亚力杨顺楷
同时，龟甲万公司开发生产的用于茶饮料方面的丹宁酶的市场动向也很看好。

茶饮料制造过程或产品中，当温度降低时，咖啡因与儿茶酸复合体会发生反应而产生沉淀。

为防止这种沉淀和儿茶素的涩味，需要利用丹宁酶（使之变的味柔和及减少沉淀）。

虽然在日本大多采用提纯提取法生产茶饮料，利用膜技术去除茶饮料中的单宁和抑制沉淀的也不少。

但是，最近由于150mlPET（聚酯）瓶装茶饮料产品出现于市场，消费者要求的是更有透明度的茶饮料产品以及有高含量儿茶素而又抑制涩味使之更低的产品，由此利用丹宁酯处理绿茶饮料应运而生，粉墨登场了。

劉詩瑋 (97) 五倍子經Aspergillus oryzae NCH-42發酵或其單寧酶處理對其
機能性之影響
Aspergillus oryzae NCH-42 固態發酵生產單寧酶之探討與應用
四、酶法生产没食子酸技术
本技术利用分离选育得到具有高单宁酶活性的黑曲霉菌株，在培养条件下，生物转化五倍子单宁酸生产GA。

中间试验采用的技术路线为：斜面菌种
液体深层Ⅰ级种子培养→ 500LⅡ级主发酵→投加倍酸底物→生物转化→目标产物没食子酸的分离回收。

转化液中没食子酸产物浓度达到5％（W/V），产物分离回收率90％以上。

在二级培养发酵的优化工艺条件下，分批补料添加五倍子单宁酸到发酵液浓度达到8.3%时，生物转化时间48-60hr，GA累积在液体反应混合物中的浓度达到≥41.6g/L，以五倍子单宁酸计，产品产率49.9%，样品经理化分析测试，质量完全与国标GB5309-85一致；此外，菌丝体（干重）得率13.1 g/L，粗蛋白含量达30%以上。

上海易利生物科技有限公司
中科院信息咨询中心单宁酶为一种水解酶，主要用于降解茶饮料制备中生成的茶乳凝，消除“冷后浑”现象，降低茶汤浑浊度，提高制取率，同时提高滋味强度，从而改善速溶茶与茶饮料制品品质。

在茶叶速溶饮料、冷饮料、保健饮料逐渐成为时尚的今天，这一产品具有广阔的市场前景。

单宁酶用于茶饮料生产，增加成本极低。

以生产1000ml酶液为例，综合成本2.5元，可制得59克寄存定化酶，连续处理408升茶汤，每升饮料成本仅为0.00625元。

上海鼎杰生物科技有限公司
单宁酶TANNASE
产品特性单宁酶完全符合联合国粮农组织（FAO），联合国卫生组织（WHO）和
食品化学药典（FCC）所规定的食品级酶制剂标准。

活力：200单宁酶单位/克
外观：粉体
水溶性：溶于水温度的影响单宁酶的最佳作用温度为45-50℃，不过在相宜的pH和培养温度
下作用温度更广。

pH值的影响单宁酶的最佳pH值为4.5-6.0，有效作用pH值为4.0-7.0。

添加量单宁酶推荐添加量为单宁重量的0.03-0.10% 储存及稳定性单宁酶在10℃以下储存，至少可以保存12个月。

样品最小包装单宁酶以100g/包
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