4 酶和细胞的固定化

第四节
固定化酶、细胞的应用
用于生物大分子的固相合成和序列分析、亲 和分离、固相免疫分析、载体药物及试剂、
生物反应器及生物传感器等
领域：发酵、制药、轻工业、医学、监测、
化学分析、能源、生化基础理论研究等
一、生物化学等基础研究
（一）酶的结构与功能研究
阐明酶反应机理
酶亚基性质的研究
揭示酶原激活机理 研究蛋白质分子结构
• 包埋：这是固定细胞最主要的方法 • 吸附：固定化动植物细胞的主要方式，但 是难于大规模生产
酶和细胞的固定化载体
载体必须符合的条件：
• ①固定化过程不引起酶变性
• ②对酸碱有一定的耐受性
• ③有一定的机械强度 • ④有一定的亲水性及良好的稳定性
• ⑤有一定的疏松网状结构，颗粒均匀
• ⑥共价结合时具有可活化基团 • ⑦有耐受酶和微生物细胞的能力
酶活的损失 增加了生产的初始成本 只用于可溶性和小分子底物 不适于多酶或需要辅酶的反应 胞内酶必需经过分离
第二节 固定化酶的制备
制备的基本原则：
（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）有利于生产自动化、连续化 （3）固定化酶应有最小的空间位阻 （4）酶与载体必须结合牢固
（5）固定化酶应有最大的稳定性
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联； （b）酶分子被偶联到水不溶性载体上
4
包埋法
将聚合物的单体和酶溶液混和后， 再借助聚合促进剂(包括交联剂)的作用进 行聚合，使酶包埋于聚合物中以达到固定 化酶方法。
特点：由于酶本身一般不参与结合反应，因而比 较安全。不过在化学聚合的过程中由于自由基的 产生、放热以及酶和试剂间发生化学反应等，也 往往可能导致酶失效。
难 高
底物特异性
结合能力
易变
弱
不变
中
不变
弱
不变
弱
再生
不可
可能
可能
不可
二
固定化细胞
细胞固定化：细胞与水不溶性载体结合制备固 定化细胞的过程。 目前，固定化细胞技术应用甚至超过了固 定化酶。例如日本和欧美各国最大规模的高果 糖浆生产大多是采用固定化细胞的酶柱工艺。 淀粉 葡萄糖异构酶 果糖
淀粉
葡萄糖异构酶
(2)离子交换吸附法
• 原理：利用酶的侧链解离基团和离子交换剂 的相互作用而达到酶的固定化的方法。 吸附容量:一般大于物理吸附剂，通常为50150 mg蛋白/g 载体。 常用离子交换剂：
阴离子交换剂：二乙基胺乙基-纤维素、混合胺 类-纤维素、四乙氨基乙基-纤维素、410、900等。

阳离子交换剂：羧甲基-纤维素、纤维素柠檬酸 盐、Amberlite CG50等。
天然酶经过固定化后即成为固定化酶，其 催化反应体系也由均相反应转变为非均相 反应。由于固定化方法和所用载体性质不 同，制备的固定化酶可能会受到扩散控制、 空间障碍、微环境变化和化学修饰等因素 的影响，可能会导致酶学性质和酶活力的 变化。
（1）酶活力的变化
一般酶活力是下降的，一般都会考虑相应 的固定化过程可能对酶的影响，避免损害 酶的活性中心，有时在固定化反应体系中 会加入抑制剂、底物或产物以保护酶的活 性中心。
3.交联法
利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分 子与载体间、或酶分子与惰性蛋白间进行交联 反应以制备固定化酶的方法。 交联试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、 双偶氮苯等。
特点：操作简便，但反应往往比较激烈，酶易
在固定化过程中失效，酶回收率不高。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
1953年，Grubhofer & Schleith 第一次酶固定化
1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于 DL-AA的光学分析上 1971年，Immobilized enzyme名称提出
1973年，固定化微生物的应用
1976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精
1978年，日本用固定化细胞生产酶
•形状：酶膜、酶管、酶纤维、微囊和颗粒状
（1）颗粒状固定化酶 包括：酶珠、酶块、酶片和酶粉等。
特点：制备简单，颗粒比表面大，转化效 率高，适用于各种类型的反应器。 （2）纤维状固定化酶
只适用于填充床反应器，已有多种酶被制 备出来。 （3）管状固定化酶 已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管。
2、固定化酶的性质
（6）固定化酶成本要低
酶的固定化方法
按照用于结合的化学反应的类型分类：
1.吸附法 2.共价偶联法 3.交联法
4.包埋法
酶和细胞的固定化方法
载体结合法 交联法 包埋法
网格型
微囊型 热处理（细胞）
物理吸附法 离子结合法 共价结合法
1. 吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在 其表面上而使酶固定的方法。
1979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究
1982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸 1986年，郭勇等人固定化原生质研究
1971年，第一届国际酶工程会议，
Immobilized enzyme 固定化酶：指经物理或化学的方法处理，使酶
变成不易随水流失即运动受限制，而又能发 挥催化作用的酶制剂。
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
• 极易将固定化酶与底物、产物分开；
• 可以较长时间内反复分批反应和装柱连续反应
• 能够提高酶的稳定性；
• 反应过程能够加以严格控制；
• 简化了提纯工艺；
• 更适合于多酶反应；
• 可以增加产物的收率，提高产物的质量； • 酶的使用效率提高，成本降低。
同时，固定化酶也存在一些缺点：
第四章 酶和细胞的固定化
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
主 要 内 容
固定化技术
固定化酶的制备 固定化酶的性质
固定化酶、细胞的应用
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 固定化
间歇
吸附 包埋 间歇 交联 连续 化学偶联
直接利用微生物酶—— （1）不稳定。在高温、高压、强酸、强碱下。 （2）易失活。即使在最适合的条件下反应。
包埋法的二种类型：
• 格型包埋：将酶分子分散包埋在聚合的胶格中
• 微囊型包埋：将一定量的酶溶液包在半透性的
微孔膜内 这两种方法都适用于底物和产物都是小分 子的酶的固定。
格型包埋
微囊型包埋
（四） 固定化酶的制法及其特性比较
特性
共价键 结合法 制法 酶活力 难 高 离子 结合法 易 高 难 中 易变 强 不可 制备方法 交联法 物理 吸附法 易 低 包埋法
物理吸附 吸附法 离子交换吸附法
(1)物理吸附法
通过氢键、疏水键和电子亲和力等物理作
用力将酶固定于不溶性载体的方法. • 无机吸附剂:高岭土、皂土、硅胶、磷酸 钙胶、氧化铝及微孔玻璃等 • 有机吸附剂:纤维素、胶原以及火棉胶等
特点:
• 无机吸附剂：吸附量一般很低,易使某些酶 发生吸附变性; • 有机吸附剂：吸附容量通常高一些, 一般 不会产生吸附变性的情况。 • 例如：火棉胶对木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯 酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的吸附容量可达 70毫克蛋白/cm2膜
果糖
玉米淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖浆 → 膜 过滤 → 离心、浓缩 → 异构化 → 部分变成 果糖（42%）→混合 →浓缩、精制→ 55%高果 糖浆
参与的酶： α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶
微生物细胞固定化 植物细胞固定化
动物细胞固定化
原生质体固定化
固定化细胞受到重视的主要原因是：
（2）酶稳定性的变化
大部分酶固定化后稳定性有不同程度的改善。包括：
操作稳定性：半衰期在1个月以上，可以认 为其具有一定的工业应用价值；
贮藏稳定性：一般固定化后应立即使用，但 保存方法得当则其贮藏很长时间后，其酶活 仍然具有可操作性；
对蛋白酶的稳定性：固定化酶对蛋白酶具有 很高的稳定性。
（3）酶学特性的变化

吸附法的优点:
操作简便，条件温和，酶分子的构象基本 不发生变化，吸附剂可再生反复使用。 缺点:
酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜 的pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下 解吸脱落。
2. 共价偶联法
借助共价键将酶的活 性非必需侧链基团和载体 的功能基团以共价键结合 制备固定化酶的方法。 特点: 得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、 利于连续使用，是目前应用和报导的最多的一类 方法;反应一般比较激烈.
（3）回收困难。用适当方法提取目的产物后，残 存酶回收困难。 （4）反应速度减慢。随着反应时间的推移。
（5）经济上不合算。一次性反应后不能再次使用 阻碍了微生物酶的应用和发展，研制固定化酶和固 定化菌体
第一节 固定化技术
固定化酶（细胞）的由来和发展
1916年，Nelson & Griffin “酶不溶于水而具有活性” 1948年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶
• ⑧廉价易得
固定化的载体
吸附载体：主要有物理吸附和离子吸附两种
包埋载体：主要有卡拉胶、海藻胶等。
共价结合载体：有纤维素、Sephadex A200、
琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。 交联法是通过双或多功能试剂进行固定化， 不需要载体。
第三节
固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状
固定化酶的物理形状不仅是为了适应不 同的应用目的及反应类型，其最终形状还与 基质的性质和制备方法有关。
底物专一性 最适pH 最适温度 动力学常数 最初反应速度等
固定化酶活力的测定方法
一般情况：单位时间内，单位体积中的底 物减少量或产物增加量来表示
特殊情况：通常在酶促反应中，如底物具
有光吸收、旋光、电位差或荧光等性质的
变化，可以进行直接测定。
固定化酶的指标
相对酶活力
酶的活力回收率 固定化酶的半衰期
(1)它可以大大降低成本，省去酶的分离 纯化工作，减少酶的活性损失。这对于细胞 内酶与不稳定的酶来说特别有意义，而且固 定化细胞的制备与使用都比固定化酶简便。 (2)固定化细胞可以作为单一的酶发挥作 用，也可利用它包含的复合酶系完成部分的 代谢或发酵过程，包括那些需要辅助因子参 与的合成代谢过程。
细胞固定化的方法：
（二）生物活性蛋白的定向固定作为 揭示蛋白内部反应和功能的工具
定向固定的方法：
利用抗体进行蛋白质的定向固定
利用糖蛋白中的糖组分定向固定
使用金属络合物的定向固定
生物素-亲和素系统
二、亲和分离系统
三、药物控释载体
聚合物修饰 凝胶包埋 微球控制
脂质体
导向药物
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ