第三章 培养基

② 糖蜜
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。
糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖 蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。
不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的， 但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预 处理。 例：谷氨酸发酵 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐
YPS培养基(1L)： 酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取 物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2
二、按状态
1. 固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也 广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的 生产 2. 半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的 琼脂，一般用量为0.5%～0.8% , 主要用于微生物的鉴 定。 3. 液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或 不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
一、碳源 1、作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌 体所必需的碳成分
提供合成目的产物所必须的碳成分
2、来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃
3、工业上常用的糖类 ① 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应
工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到
一定的质量指标
不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大
早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
有些产物会受氮源的诱导和阻遏
例： 蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感
兴趣的课题
三、无机盐的微量元素
1、作用：各种不一样 2、来源：C、N源，以盐的形式补充
pH 4.25 5.45 4.62 酶活 120分钟 30分钟 75分钟
不加 加 K2HPO4 加 KH2PO4
四、生长因子、前体和产物促进剂
1、生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的 有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生 长因子。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺 陷型，以生物素为生长因子, 生长因子对发酵的调控 起到重要的作用 。 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮 源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生 长不可缺少的生长因子 。
3．发酵培养基
发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗 用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的 重要因素。 （1）根据产物合成的特点来设计培养基 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足 细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培 养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的 铵盐或尿素等氮素化合物。
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清 洁的水。
第三节 发酵培养基的设计和优化
目前还不能完全从生化反应的基本原理来推 断和计算出适合某一菌种的培养基配方 只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等 的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌 种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性， 采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的 实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。
③ 淀粉、糊精 使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类 缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定 的α-淀粉酶；成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等 等。 优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应
例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶 碳源对生长和产酶的影响 碳源 葡萄糖 蔗糖 糊精 淀粉 细胞量 4.2 4.02 3.06 3.09 α-淀粉酶 0 0 38.2 40.2
例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算 如下∶
葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为∶ C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为∶ 2*46 Y = ─── = 0.57 162
（二）实验设计
培养基成分的含量最终都是通过实验获得的 合理的实验方法
2．种子培养基 (包括摇瓶种子和小罐种子培养基)
培养种子的目的： 扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。 为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。
种子培养基特点： 1. 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要 充足的氮源和生长因子。 2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。 供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些 易被吸收利用的碳源和氮源。 3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主 要成分相近。
促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方 面的。
有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改 善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
五、水
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因 为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响 甚大。 水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可 溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻
单因子实验 多因子实验：均匀设计、 正交实验设计、 响应面分析等。
三、培养基设计的步骤
① 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分； ② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； ③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。
3、用量：根据具体的产品，以实验决定 4、使用注意点
A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离 子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理
B、使用时注意盐的形式（pH的变化）
例：黑曲酶NRRL-330, 生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下 了酸性或碱性物质。 经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无 机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺; 若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称 为生理碱性物质，如硝酸钠。 正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程 的pH有积极作用。
所以选择合适的无机氮源有两层意义：
原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业
化生产 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性
培养大肠杆菌常用两种培养基
M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4∙7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10g, pH 7.0
满足菌体生长
稳定和调节发酵过程中的pH
毛霉产蛋白酶的研究
陈涛，中国酿造，2004
初始pH的影响: pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大
无机氮源的影响： 硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素
2、有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。
（ 2 ）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能 高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于 提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。 （ 3 ）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来 源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。
第二节 发酵培养基的成分及来源
碳源 氮源 水 微量元素(无机盐类) 生长因子
第三章 培养基
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细 胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。 同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它 所必须的条件。 培养基的作用： 满足菌体的生长 促进产物的形成
发酵培养基的要求 ① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳 定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能 保证生产上的供应。 ④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不 应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。
例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程 进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳 定性。 所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑 原料的波动对发酵的影响。
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用
三、按用途（从发酵生产应用考虑） 1. 孢子（斜面）培养基 2. 种子培养基 3. 发酵培养基
1．斜面培养基
作用：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包括细 菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢 子培养基或麸曲培养基等。 这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的 各类营养物质。
斜面培养基特点： 1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利 于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和 碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成 孢子。 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的 生长因子和微量元素。
第一节 培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的组成、状态、用途可分为三大类型 一、按组成物质的化学成分 1. 合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定

适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律
培养基营养单一，价格较高，不适合来自百度文库于大规模工业 生产
2. 天然培养基: 采用天然原料 （或各种浸出物、水解液）
用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和 氧化，流加也有利于提高前提的转化率
3、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物， 又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
一、培养基成分选择的原则
菌种的同化能力 代谢的阻遏和诱导 合适的C、N比
pH的要求
二、成分含量的确定 （一）理论转化率与实际转化率
理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢 途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制 的一个目标
2、前体 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被 微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其 自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入 前体而有较大的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
作用：前体有助于提高产量和组份
用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个 转化率的问题 例：6000单位/ml的青霉素G, 需要多少苯乙酸 青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38% 实际使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素） 转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%
(半纤维素酶)
(1.5g麸皮)
李江华，无锡轻工大学学报，2004
嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响
苏勤，林业化学与工业，2004
结果：各种碳源相差不大
推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型
二、氮源
氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、 核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类： 有机氮源和无机氮源。 1、无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅 速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起 pH的变化如： (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH