羧基磁珠与蛋白偶联方法

来源：时间：2009-6-6 23:34:26
简介
BioMag 和 BioMagPlus 超顺磁珠适用于磁分选细胞、细胞器、蛋白、免疫球蛋白、核酸及其它生物或非生物体系中的分子。

BioMag 和 BioMagPlus 磁珠表面不规则，因此具有比较大的表面积，可以增加磁珠与偶联分子的接触机率，提高偶联效率。

此外，这两种磁珠90%以上为氧化铁，可以加快磁分选速度，这特别适用于大批量，高能量分选样品。

BioMag and BioMagPlus 磁珠采用的工艺制备，只不过BioMagPlus经过了另,外的去除细尘处理，偶联试剂盒中提供的就为此类磁珠。

BioMagPlus 羧基磁珠表面的羧基经过二亚胺EDAC活化后，即可以与蛋白偶联。

Bangs 公司的 BioMagPlus Carboxyl Protein Coupling Kit 适用于蛋白与 BioMagPlus 超顺磁珠的偶联，此kit提供了可供5次偶联的试剂和磁珠。

材料
• BioMagPlus 羧基磁珠: ，μm ，20 mg/mL
• EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide):
• 15mL 尖头离心管: 5 tubes
• BioMag 磁分离器
• MES 缓冲液 (pH : 2 x 175mL
•淬灭液 (1M Glycine, pH : 25mL
•洗涤缓冲液: 125mL
实验步骤
活化
•移取 (10mg) 的 BioMagPlus 羧基磁珠至 15mL 尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清。

•加 5mL of MES 缓冲液充分混匀洗涤. 将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。

•重复 Step 2, 三次. 最后一次洗涤后, 重悬磁珠于 5mL 的 MES 缓冲液中。

•将 EDAC 从冷藏处取出置于室温30分钟。

准确称取所需的EDAC EDAC/mg BioMagPlus 磁珠)加入装有磁珠的离心管内，
•剧烈振荡摇匀。

•室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应 30 分钟。

反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚积在一起。

•将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。

•重复 Step 2, 四次。

蛋白偶联
计算需要偶联的蛋白，抗体量. 一般地，每mg活化的羧基磁珠可以偶联20-500ug的蛋白（抗体），可适量添加一些载体蛋白，如BSA Fraction V，增加反应体系中的总蛋白量，从而可以起到一定的封闭作用。

保证抗体偶联的正确方向。

•将蛋白加至 5mL MES 缓冲液中。

•吸取 50μL 蛋白液于950μL的MES缓冲中. 配成1：20的稀释液. 标记为偶联反应前蛋白液.置于一旁用于后面的偶联率计算。

•将剩下的蛋白液加到装有活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应16-24小时。

•将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心收集上清. 标记为偶联后蛋白液，用于计算偶联率。

•重悬磁珠于 5mL MES 缓冲液中，振荡摇匀。

将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。

•重复 Step 6, 一次
•加 5mL 的淬灭液，振荡摇匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上 30 分钟。

•将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。

洗涤和贮存偶联后的磁珠
•加 5mL 洗涤缓冲液并剧烈振荡摇匀。

将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。

•重复 Step 1, 三次。

•最后一次洗涤后, 重悬磁珠于 2mL 洗涤缓冲液内，此时磁珠的浓度约为5 mg/mL.
•置于 2-8摄氏度保存。

Notes
•偶联时切记不要用有氨基 . Tris) 或是羧基的 . acetate, citrate) 缓冲液。

•偶联时，非偶联的吸附无可避免会有一些，这可以通过偶联后的洗涤来去除。

•延长振荡的时间有利于重悬 BioMagPlus 磁珠。

贮存
贮存于2-8˚C。

冷冻, 干燥, 或是离心都可能会使磁珠发生不可逆的聚积，影响实验结果。