反义核酸药物
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使蛋白质的表达受到抑制。
核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)技术
核酶是一类本身具有酶的剪切活性的ＲＮＡ,也是反 义技术的一部分,它能序列特异地催化切割靶ＲＮＡ,故 也可用来封闭ＲＮＡ的功能。
核酶的作用原理为核酶的特异性序列通过互补碱
基对形成识别并结合特异性靶ＲＮＡ,故可以人工设计 针对某一靶ＲＮＡ的核酶,破坏靶ＲＮＡ。
缺点是： 天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一
旦进入又容易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。 为此，人们采用药物化学的原理和方法，对天然寡核苷
酸进行化学修饰，以达到治疗药物的要求。
国外已有反义药物应用于临床,Ｓｃｉｅｎｃｅ 杂志1998年7月报道了第一个通过ＦＤＡ认证的反义 药物,即用于治疗艾滋病人巨细胞病毒感染的视网膜
PS-ODN是至今研究最深入、应用最广泛的一类 asODN，它有效增强了对核酸酶稳定性、具有良好的 水溶性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。
PS-ODN与天然ODN相比： 通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长最 终细胞内浓度也更高；
t1/2一般都大于24h，极大的提高了对核酸酶的耐受 力；
➢3′＿3′ 5′＿5′连接修饰: 考虑到核酸酶只识别3′ ,5′磷酸二 酯 键 , 故 合 成 一 类 具 有 3′ ＿ 3′ 5′ ＿ 5′ 颠 倒 连 接 末 端 的 asON(ＩＮＶ＿asON),结果使核酸酶不能识别。
第3条途径-----肽骨架
基于asON发挥特异性抑制基因表达的关键在于其 碱基排列顺序,而与易于降解的磷酸和糖环组成的磷酸 二酯键骨架无关。所以,asOD的磷酸-糖骨架以肽键取代， 得到新型的化合物----多肽核酸(ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕ ｃｌｅ ｉｃ ａｃｉｄ, ＰＮＡ)。
第4条途径----构建嵌合体结构的反义核酸
即综合应用多种化学修饰,效果很好,有“第二代 反义药物”之称。它以PS-ODN为核心，两翼序列上 的核糖的2’位被其它基团修饰。除了化学修饰，还可 以试作转基因表达反义核酸，在体细胞内以DNA为模 板转录产生,模拟天然ＲＮＡ的形成过程,这样表达的 反义ＲＮＡ可能在细胞内被天然修饰,从而稳定性得到 提高。
核酶药物 近年来利用反义核酸和核酶进行抗病毒 治疗已有进展。将核酶基因以合适的载体导入细胞内， 在细胞内转录产生核酶，从而发挥抗病毒作用。
Fra Baidu bibliotek
反义RNA调节翻译的基本原理是：
1、反义RNA与mRNA有互补序列，根据碱基互补原则，能 相互结合，形成mRNA-反义RNA杂交体，阻断mRNA的翻 译。 2、反义RNA和mRNA的结合可发生在细胞核中，也可发生 在细胞质中。如发生在核中，就会干扰mRNA的加帽和加尾 以及剪接和加工过程，也会干扰mRNA从细胞核向细胞质的 转运。 3、RNA杂交分子不稳定，易被核酸酶降解。 4、反义RNA与胞质中成熟的mRNA杂交，抑制其翻译成蛋 白质。
三、反义药物的特点,设计和导入方法
特点
1. 选择性强: asON只作用于靶基因,不与非相关基因作用, 特异性高，且片断短,合成方便、经济;
2. 效率高: asON几乎可以完全阻断靶基因的翻译; 3. 低毒: asON作用于局部,对全身影响小。
反义核酸药物是药理学的新领域或革命:
新的药物——反义寡核苷酸 新的药物受体—— mRNA 新的受体结合方式——Watson-Crick杂交 新的药物受体结合后反应: （1） RNase H介导的靶RNA 的降解； （2）抑制DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译 等。
这些区段均为基因表达的关键区或敏感区,对基因的 调控起重要的作用。
一般而言,只要人工设计合成15----20个碱基长度的 反义ＤＮＡ或反义ＲＮＡ,就足以使此反义核酸与靶ｍＲ ＮＡ形成结合作用,且这种结合调节是非常特异性的。
2、稳定性(ｓｔａｂｉｌｉｔｙ)
asON 的 功 能 在 很 大 程 度 上 取 决 于 其 稳 定 性 ,asOD 在体内生理条件下,很容易被各种核酸酶降解,这样就根 本无法达到阻遏ｍＲＮＡ翻译的目的。因此,人们对反
例如： 大肠杆菌质粒Pmb1(Col E1)复制是通过 RNA
I（反义RNA）实现抑制作用。
该质粒复制起始时，引物 (RNA II) 与其模板链结合， 并在DNA聚合酶参与下合成新的DNA子链。但是很快就 有一种长约100个核苷酸的反义RNA分子 (RNA I) 生成。 RNA I与RNA II -552----447核苷酸互补,且互补区位于复制 起始位点上游,它在Col E1复制过程中能与RNAⅡ的5’-末 端互补结合，使其构型改变，从而阻碍了RNAⅡ与DNA模 板链的结合，RNAⅡ不再起到引物的作用，质粒DNA的复制 终止。 见图示：
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反 义ＤＮＡ/ ＲＮＡ序列。这些区段主要包括:
5′端帽子结构区; ｍＲＮＡ的起始编码区或编码区; 核前体ｍＲＮＡ的拼接区; 反转录病毒的引物区等。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译；
2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始；
3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的 翻译。
如： 1、在胞嘧啶的5位点甲基化（最常使用） 2、使用三氟甲基、咪唑丙基、炔丙基等。
-CH3
DNA chain
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸(phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
但由于PS-ODN其本身带有大量的负电荷，能与 多种因子结合从而导致非特异效应。在体内表现出剂 量依赖的毒副作用。
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′ 连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别 磷酸二酯键。
➢α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。 ➢1’位取代、2’位取代: 指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。 如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后,也使asＯＮ具 备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。
1983年Mizuno和Simon等同时发现反义RNA的调节作 用，进而揭示了一种新的基因表达调节机制。
20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，反义 核酸的研究快速发展起来。有人将它与20年前单克隆抗 体的问世相比拟，认为该项技术的成熟化有望获得一类 可以“根治”肿瘤、遗传性疾病、病毒性疾病等多种疑 难杂症的新型药物。反义技术正孕育着药物学和药理学 上的一次革命。
药物的研究与开发取决于两个重要的参数：
1、确定疾病发展过程中的合适靶点；
2、发现能特异性识别并能与该靶点结合的化合物，从 而干预疾病的发展过程。
反义寡核苷酸作为药物比常规药物的治疗有更 高的特异性。
1、有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设 计、合成特异性的反义核酸比较容易；
2、反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特 异和有效的结合，从而调节基因的表达。
反义核酸：是指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之
特异性结合的一段DNA或RNA。
一般包括: ➢ 反义DNA（antisense DNA） ➢ 反义RNA（antisense RNA） ➢ 核酶（ribozyome）: 是具有酶活性的RNA，主要参加 RNA的加工与成熟。
反 义 寡 聚 核 苷 酸 （ antisense oligonucleotides ，
义核酸的结构进行各种化学修饰以提高其稳定性,增加
对核酸酶的抗性。
（1）碱基修饰：
碱基是asON与靶基因通过氢键形成而直接接触的 部位,而氢键的形成又是asON发挥功能的必要条件。因 此,该部位的修饰应以不影响氢键形成为前提。任何影 响A-T（U）/G-C碱基配对的修饰都会因碱基错配而导 致asON与靶基因的结合或特异性降低或丢失。
asON）：目前研究的热点。是一小段与mRNA或DNA特 异性结合并阻断其基因表达的人工合成的短核酸片断。
反义核酸技术：是指利用反义核酸的特异性来抑制
某些基因表达技术。
反义药物：利用这一技术研制的药物。
反义核酸可特异性地作用于靶基因或mRNA，从基因 复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基 因的表达，从而实现疾病的治疗。
GGAGG
真核细胞中反义RNA除了上述三个水平发挥作用外，
在下列阶段也呈现功能：
1、作用于mRNA 5’-末端，阻止帽子结构的形成； 2、作用于外显子和内含子的连结区，阻止前体mRNA的剪
接； 3、作用于PolyA形成位点，阻止mRNA的成熟及向胞浆的
转运； 4、与mRNA结合，使得mRNA易被酶识别而被降解，从而
炎的福米韦生(Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ, Ｖｉｔｒａｖ
ｅｎｅ),这是ISIS公司的一大成果, 此外还有多种反义 药物包括核酶在内的新一代反义药物进入临床。
二、反义药物的作用机理
反义核酸可在复制、转录、剪接、转运和 翻译 等各个环节上发挥调控作用。
其机制为：
1、在DNA复制水平上：
反义RNA可作为DNA复制的抑制因子，它可与引 物RNA互补结合，抑制DNA的复制，从而控制复制频 率。
反义核酸药物
一、概述
1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来 特异性地抑制基因表达的设想。
1978年，Zamecnik和Stephenson利用一段长13个碱基 的反义DNA寡核苷酸链成功地抑制了劳斯（Rous）肉瘤 病毒的复制，引起人们极大的关注。
1981年Tomizawa第一次报道了天然反义RNA的生物学 功能，发现在质粒DNA复制时，与引物RNA互补的RNA 分子能抑制DNA复制。
Replication of the ColE1 Plasmid
• ColE1 replication is unidirectional
ColE1 (6646 bp)
Replicon
RNAI
Origin RNAII
Colicin
2、在转录水平上：
反义RNA可与mRNA 5’-端互补,从而阻止了RNA的完 整转录。 ➢ 大肠杆菌的cAMP受体蛋白基因（CRP)的转录会受到一种 小分子反义RNA的制约。这种反义RNA可与CRP基因转 录起始生成的mRAN分子的5’-端序列互补，形成特异的 二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄-环结构， 空间构象障碍迫使RNA聚合酶脱离DNA模板，停止转录。
设计
1. 能特异地识别靶基因,并能与之稳定结合; 2. 有较长的半衰期及较强耐受核酸酶消化的能力; 3. 能通过靶细胞膜,有效的到达作用部位。
导入方法
1、RNA病毒感染; 2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加as ＯＮ到达靶细胞的能力。
由于结构上PNA与DNA类似，其两相邻碱基间距 及碱基与类肽链骨架间的距离均相近，PNA与DNA以 及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。
假肽取代磷酸二酯键后其： 特异性更强， 带电荷少、 不被蛋白酶和核酸酶识别, 亲和性更高, 副作用减少。
具有比前两代反义寡核苷酸更好的亲和力和至少 相同的序列特异性，而且也有相当的抗病毒活性。称 为第三代反义核酸。近来这种肽核酸研究很多。
近来还有人将多个不同的核酶连接在一起使切割效 率大大提高,已试用于临床,其治疗范围也已从单基因疾 病扩大至多基因疾病。
另外,在核酶基础上,人们又提出了反义核酶的概念,即 通过基因连接将反义ＲＮＡ与核酶的基因连为一体,再 转录得到具有双重功能的一类ＲＮＡ分子,对靶基因既 有封闭作用,又有切割作用。目前核酶在基因治疗领域 中颇受瞩目,属研究热点。
核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)技术
核酶是一类本身具有酶的剪切活性的ＲＮＡ,也是反 义技术的一部分,它能序列特异地催化切割靶ＲＮＡ,故 也可用来封闭ＲＮＡ的功能。
核酶的作用原理为核酶的特异性序列通过互补碱
基对形成识别并结合特异性靶ＲＮＡ,故可以人工设计 针对某一靶ＲＮＡ的核酶,破坏靶ＲＮＡ。
缺点是： 天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一
旦进入又容易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。 为此，人们采用药物化学的原理和方法，对天然寡核苷
酸进行化学修饰，以达到治疗药物的要求。
国外已有反义药物应用于临床,Ｓｃｉｅｎｃｅ 杂志1998年7月报道了第一个通过ＦＤＡ认证的反义 药物,即用于治疗艾滋病人巨细胞病毒感染的视网膜
PS-ODN是至今研究最深入、应用最广泛的一类 asODN，它有效增强了对核酸酶稳定性、具有良好的 水溶性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。
PS-ODN与天然ODN相比： 通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长最 终细胞内浓度也更高；
t1/2一般都大于24h，极大的提高了对核酸酶的耐受 力；
➢3′＿3′ 5′＿5′连接修饰: 考虑到核酸酶只识别3′ ,5′磷酸二 酯 键 , 故 合 成 一 类 具 有 3′ ＿ 3′ 5′ ＿ 5′ 颠 倒 连 接 末 端 的 asON(ＩＮＶ＿asON),结果使核酸酶不能识别。
第3条途径-----肽骨架
基于asON发挥特异性抑制基因表达的关键在于其 碱基排列顺序,而与易于降解的磷酸和糖环组成的磷酸 二酯键骨架无关。所以,asOD的磷酸-糖骨架以肽键取代， 得到新型的化合物----多肽核酸(ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕ ｃｌｅ ｉｃ ａｃｉｄ, ＰＮＡ)。
第4条途径----构建嵌合体结构的反义核酸
即综合应用多种化学修饰,效果很好,有“第二代 反义药物”之称。它以PS-ODN为核心，两翼序列上 的核糖的2’位被其它基团修饰。除了化学修饰，还可 以试作转基因表达反义核酸，在体细胞内以DNA为模 板转录产生,模拟天然ＲＮＡ的形成过程,这样表达的 反义ＲＮＡ可能在细胞内被天然修饰,从而稳定性得到 提高。
核酶药物 近年来利用反义核酸和核酶进行抗病毒 治疗已有进展。将核酶基因以合适的载体导入细胞内， 在细胞内转录产生核酶，从而发挥抗病毒作用。
Fra Baidu bibliotek
反义RNA调节翻译的基本原理是：
1、反义RNA与mRNA有互补序列，根据碱基互补原则，能 相互结合，形成mRNA-反义RNA杂交体，阻断mRNA的翻 译。 2、反义RNA和mRNA的结合可发生在细胞核中，也可发生 在细胞质中。如发生在核中，就会干扰mRNA的加帽和加尾 以及剪接和加工过程，也会干扰mRNA从细胞核向细胞质的 转运。 3、RNA杂交分子不稳定，易被核酸酶降解。 4、反义RNA与胞质中成熟的mRNA杂交，抑制其翻译成蛋 白质。
三、反义药物的特点,设计和导入方法
特点
1. 选择性强: asON只作用于靶基因,不与非相关基因作用, 特异性高，且片断短,合成方便、经济;
2. 效率高: asON几乎可以完全阻断靶基因的翻译; 3. 低毒: asON作用于局部,对全身影响小。
反义核酸药物是药理学的新领域或革命:
新的药物——反义寡核苷酸 新的药物受体—— mRNA 新的受体结合方式——Watson-Crick杂交 新的药物受体结合后反应: （1） RNase H介导的靶RNA 的降解； （2）抑制DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译 等。
这些区段均为基因表达的关键区或敏感区,对基因的 调控起重要的作用。
一般而言,只要人工设计合成15----20个碱基长度的 反义ＤＮＡ或反义ＲＮＡ,就足以使此反义核酸与靶ｍＲ ＮＡ形成结合作用,且这种结合调节是非常特异性的。
2、稳定性(ｓｔａｂｉｌｉｔｙ)
asON 的 功 能 在 很 大 程 度 上 取 决 于 其 稳 定 性 ,asOD 在体内生理条件下,很容易被各种核酸酶降解,这样就根 本无法达到阻遏ｍＲＮＡ翻译的目的。因此,人们对反
例如： 大肠杆菌质粒Pmb1(Col E1)复制是通过 RNA
I（反义RNA）实现抑制作用。
该质粒复制起始时，引物 (RNA II) 与其模板链结合， 并在DNA聚合酶参与下合成新的DNA子链。但是很快就 有一种长约100个核苷酸的反义RNA分子 (RNA I) 生成。 RNA I与RNA II -552----447核苷酸互补,且互补区位于复制 起始位点上游,它在Col E1复制过程中能与RNAⅡ的5’-末 端互补结合，使其构型改变，从而阻碍了RNAⅡ与DNA模 板链的结合，RNAⅡ不再起到引物的作用，质粒DNA的复制 终止。 见图示：
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反 义ＤＮＡ/ ＲＮＡ序列。这些区段主要包括:
5′端帽子结构区; ｍＲＮＡ的起始编码区或编码区; 核前体ｍＲＮＡ的拼接区; 反转录病毒的引物区等。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译；
2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始；
3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的 翻译。
如： 1、在胞嘧啶的5位点甲基化（最常使用） 2、使用三氟甲基、咪唑丙基、炔丙基等。
-CH3
DNA chain
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸(phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
但由于PS-ODN其本身带有大量的负电荷，能与 多种因子结合从而导致非特异效应。在体内表现出剂 量依赖的毒副作用。
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′ 连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别 磷酸二酯键。
➢α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。 ➢1’位取代、2’位取代: 指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。 如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后,也使asＯＮ具 备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。
1983年Mizuno和Simon等同时发现反义RNA的调节作 用，进而揭示了一种新的基因表达调节机制。
20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，反义 核酸的研究快速发展起来。有人将它与20年前单克隆抗 体的问世相比拟，认为该项技术的成熟化有望获得一类 可以“根治”肿瘤、遗传性疾病、病毒性疾病等多种疑 难杂症的新型药物。反义技术正孕育着药物学和药理学 上的一次革命。
药物的研究与开发取决于两个重要的参数：
1、确定疾病发展过程中的合适靶点；
2、发现能特异性识别并能与该靶点结合的化合物，从 而干预疾病的发展过程。
反义寡核苷酸作为药物比常规药物的治疗有更 高的特异性。
1、有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设 计、合成特异性的反义核酸比较容易；
2、反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特 异和有效的结合，从而调节基因的表达。
反义核酸：是指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之
特异性结合的一段DNA或RNA。
一般包括: ➢ 反义DNA（antisense DNA） ➢ 反义RNA（antisense RNA） ➢ 核酶（ribozyome）: 是具有酶活性的RNA，主要参加 RNA的加工与成熟。
反 义 寡 聚 核 苷 酸 （ antisense oligonucleotides ，
义核酸的结构进行各种化学修饰以提高其稳定性,增加
对核酸酶的抗性。
（1）碱基修饰：
碱基是asON与靶基因通过氢键形成而直接接触的 部位,而氢键的形成又是asON发挥功能的必要条件。因 此,该部位的修饰应以不影响氢键形成为前提。任何影 响A-T（U）/G-C碱基配对的修饰都会因碱基错配而导 致asON与靶基因的结合或特异性降低或丢失。
asON）：目前研究的热点。是一小段与mRNA或DNA特 异性结合并阻断其基因表达的人工合成的短核酸片断。
反义核酸技术：是指利用反义核酸的特异性来抑制
某些基因表达技术。
反义药物：利用这一技术研制的药物。
反义核酸可特异性地作用于靶基因或mRNA，从基因 复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基 因的表达，从而实现疾病的治疗。
GGAGG
真核细胞中反义RNA除了上述三个水平发挥作用外，
在下列阶段也呈现功能：
1、作用于mRNA 5’-末端，阻止帽子结构的形成； 2、作用于外显子和内含子的连结区，阻止前体mRNA的剪
接； 3、作用于PolyA形成位点，阻止mRNA的成熟及向胞浆的
转运； 4、与mRNA结合，使得mRNA易被酶识别而被降解，从而
炎的福米韦生(Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ, Ｖｉｔｒａｖ
ｅｎｅ),这是ISIS公司的一大成果, 此外还有多种反义 药物包括核酶在内的新一代反义药物进入临床。
二、反义药物的作用机理
反义核酸可在复制、转录、剪接、转运和 翻译 等各个环节上发挥调控作用。
其机制为：
1、在DNA复制水平上：
反义RNA可作为DNA复制的抑制因子，它可与引 物RNA互补结合，抑制DNA的复制，从而控制复制频 率。
反义核酸药物
一、概述
1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来 特异性地抑制基因表达的设想。
1978年，Zamecnik和Stephenson利用一段长13个碱基 的反义DNA寡核苷酸链成功地抑制了劳斯（Rous）肉瘤 病毒的复制，引起人们极大的关注。
1981年Tomizawa第一次报道了天然反义RNA的生物学 功能，发现在质粒DNA复制时，与引物RNA互补的RNA 分子能抑制DNA复制。
Replication of the ColE1 Plasmid
• ColE1 replication is unidirectional
ColE1 (6646 bp)
Replicon
RNAI
Origin RNAII
Colicin
2、在转录水平上：
反义RNA可与mRNA 5’-端互补,从而阻止了RNA的完 整转录。 ➢ 大肠杆菌的cAMP受体蛋白基因（CRP)的转录会受到一种 小分子反义RNA的制约。这种反义RNA可与CRP基因转 录起始生成的mRAN分子的5’-端序列互补，形成特异的 二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄-环结构， 空间构象障碍迫使RNA聚合酶脱离DNA模板，停止转录。
设计
1. 能特异地识别靶基因,并能与之稳定结合; 2. 有较长的半衰期及较强耐受核酸酶消化的能力; 3. 能通过靶细胞膜,有效的到达作用部位。
导入方法
1、RNA病毒感染; 2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加as ＯＮ到达靶细胞的能力。
由于结构上PNA与DNA类似，其两相邻碱基间距 及碱基与类肽链骨架间的距离均相近，PNA与DNA以 及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。
假肽取代磷酸二酯键后其： 特异性更强， 带电荷少、 不被蛋白酶和核酸酶识别, 亲和性更高, 副作用减少。
具有比前两代反义寡核苷酸更好的亲和力和至少 相同的序列特异性，而且也有相当的抗病毒活性。称 为第三代反义核酸。近来这种肽核酸研究很多。
近来还有人将多个不同的核酶连接在一起使切割效 率大大提高,已试用于临床,其治疗范围也已从单基因疾 病扩大至多基因疾病。
另外,在核酶基础上,人们又提出了反义核酶的概念,即 通过基因连接将反义ＲＮＡ与核酶的基因连为一体,再 转录得到具有双重功能的一类ＲＮＡ分子,对靶基因既 有封闭作用,又有切割作用。目前核酶在基因治疗领域 中颇受瞩目,属研究热点。