(推荐)抑菌活性实验方案

八宝景天抑菌活性实验方案

1 材料与仪器

1.1 材料

八宝景天（茎、叶、花），采摘于吉林农业大学校园，去离子水洗净，阴干，经粉碎机粉碎(过40～60 目筛)，所得植物粉用密封袋于遮光处保存备用。

1.2 微生物

真菌：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科学研究院提供。番茄叶霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜茎腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。

1.3 试剂与仪器

95%乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司

葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司

琼脂粉生化试剂天津科密欧化学试剂有限公司

马铃薯

JFSD-100粉碎机上海淀久中药机械制造有限公司

JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂

RE-2000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂

SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂

TDL-5A低速大容量离心机上海悦丰仪器仪表有限公司

生化培养箱SPX-250型上海跃进医疗器械厂

ZKF035电热真空干燥箱上海实验仪器厂有限公司

KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司

不锈钢手提式灭菌器上海申安医疗器械厂

超净工作台上海生物科技有限公司

1.4 培养基的制备

真菌都用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)

马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值自然

培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管或锥形瓶中。分装后121℃灭菌20min。

2 试验方法

2.1植物提取液的制备

准确称取100 g的样品，于250 ml锥形瓶中，加入200 ml 95%的乙醇，室温下，超声提取45 min，连续提取3次，过滤粗提物，离心（3500 r/min,20 min），过滤除杂，滤液用旋转蒸发仪浓缩至干，4 ℃冰箱中保存备用。

2.2八宝景天（茎、叶、花）提取物抑菌活性的测定

抑菌试验样品的准备：称取一定量的提取物，用20%（体积分数）乙醇将植物提取物配制成质量浓度为10 g/ml的供试药液做抑菌试验用。

菌的活化培养：供试真菌从 4 ℃冰箱取出，接种于具有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的培养皿中，于28℃下活化培养，待菌丝长满整个培养皿的80%时备用。

菌悬液的制备：取一定量已活化的供试菌于装有50mL的液体PDA培养基的锥形瓶中，制成菌悬液于28℃下培养48h，用无菌的移液管取1.0mL培养好的菌悬液于试管中，加入9.0mL的无菌水依次梯度稀释，每稀释一个试管，浓度降低10-1，用稀释培养基测数法测菌体个数，调至浓度为6.8×106CFU/mL（指每毫升样品中含有的细菌群落总数）。

八宝景天（茎、叶、花）提取物抑菌活性的测定采用菌丝生长速率法、稀释培养基测数法。

2.2.1菌丝生长速率法

又称抑菌圈法或琼脂平板法。生长速率是指将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢来

判断药剂毒力大小的方法，以一定的时间内菌落直径的大小来表示。

菌丝生长速率法试验步骤：1）制备带毒培养基平面准确的吸取一定量的上述植物提取物加入到已融化的培养基中，混合均匀倒入已灭菌的培养皿内，冷却后即成带毒的培养基平面2）接种病原菌用无菌打空器将已活化的菌制成直径为6mm的菌饼，用无菌镊子将菌饼接入平板中央，每培养皿放置1 个菌饼，置于25 ℃~28 ℃的电热恒温培养箱黑暗培养。3）结果采用十字交叉法测定菌落直径,按以下公式计算抑制率：

抑制率=[(CK菌落直径-0.6)-(处理菌落直径-0.6)]/(CK菌落直径-0.6)×100%

2.2.2稀释培养基测数法

根据微生物在高度稀释条件下，固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的技术方法，即一个菌落代表一个单细胞。

稀释培养基测数法试验步骤如下：1）稀释培养基测数法(最大或然数计数法Most probable number，MPN)测定每毫升原培养液含活菌数，根据MPN所得结果将原培养液稀释成约100CFU/mL；2）吸取20μL菌悬液于含提取物的固体培养基的平板中，用涂菌棒涂布均匀静置15 min，将培养基平板倒置(防止皿盖冷凝水下滴)于28℃生化培养箱培养24 h；3）数菌落数，对照组菌落数记为C0，涂布提取物平板菌落数记为C，按下式计算抑制率：

萌发率=萌发率= 孢子萌发数/ 检查孢子总数=C/C0×100%

抑制率(%)=(对照萌发率- 处理萌发率)/ 对照萌发率=(C0-C)/C0×100%

以上每种试验方法重复三次。

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