细菌培养系统常用液体配制标准SOP操作规程样本

细菌培养系统常用液体配制标准SOP操作规程样本

1、LB培养基:

每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。

2、固体培养基:

LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：

注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）

注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

5、细菌培养：

配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性

培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。

6、化学感受态制备：

1）原理:：

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。将细菌置于0℃，低渗CaCl2 溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。外源DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短暂的热冲击处理（一般热休克90s）后能促进细胞吸收外源DNA 复合物。

2）仪器、材料与试剂：

①超净工作台、低温离心机、摇床、-80℃冰箱，装液氮的泡沫盒及液氮、50ml的离心管2个，50ml的注射器及0.22um小过滤器各1个。高压灭菌的纸张、透气膜、1.5ml的EP管约350-500个，两块10cm的平皿板及接种环。

②TB缓冲液：每200ml液体中含Mncl2.4H20(2.176g)、Cacl2.2H2O(0.44g)、Kcl(3.73g)、PIPES(0.67g)。（注：在电子天平上的误差<50mg,因Mncl2.4H20在PH=6.7易溶故先将其它药品用超纯水溶解,并用KOH及HCL调PH至6.7。在加入Mncl2.4H20溶解后用超纯水定溶至相应的量，采用50ml的注射器及小过滤器过滤,一般储存在-20℃,时间<25天,否则易被氧化颜色呈粉红。）

③LB液体培养基：参见前面介绍。

④LB固体培养基：参见前面介绍。

⑤1管DH5α的菌种

3）步骤：

①倒无抗性的固体培养板，用接种环沾取感受态甘油菌画线,置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

②在超净台里采用小枪尖挑取培养板中的单克隆菌(菌落的大小约2~3mm)转接于200~250ml的LB液体培养基中,盖上透气膜。

③置于摇床上，18℃、200- 250rpm速度摇约需3~5天，使OD600=0.4~0.7（对数生长期或对数生长前期）时开始制备。

④取出TB缓冲液及无菌的50ml离心管置于4℃冰浴中，预冷低温高速离心机（4℃、2500rpm、10min）。

⑤在50ml的离心管中加入约35ml-45ml的菌液，在4℃中冰浴10min。

⑥取出后放置于离心机上离心4℃、2500rpm、10min。

⑦弃上清液，在灭过菌的吸水纸上扣干（可重复多次收集菌体），先用约5~15ml的TB缓冲液重悬，再加至35ml的量（在冰上操作）冰浴10min。

⑧重复⑥+⑦的步骤一次。

⑨在35ml的TB缓冲液重悬后缓慢加入终浓度为7%的DMSO，混匀后在冰上冰浴10min。

⑩分装成100-150ul/管（1.5ml的EP管）浸入液氮中速冻，分装约300多管后转移放置于-80℃冰箱保存。

4）转化效率的评估：

①采用小量质粒快转（冰浴10min→42℃热休克90s→冰浴2min →加无抗性LB液体培养基200ul→37℃摇床复温培养30min）。

②涂Kn、AP抗性板并做阴性对照（采用ddH20代替鉴定用的大提标准质粒），可以评价出是否有染菌、突变、转化效率。

③可以用Er2566等感受态做平行对照，评估其的生长快慢情况及转化效率的高低。

转化效率=转化子总数/质粒DNA加入量（1ug/ul）,标准质粒为大提用的N31-EGFP。

5）注意事项：

①严格按照标准操作步骤，整个操作过程要注意温度（4℃冰上操作）且洁净的超净台环境防止污染。

②直接从-80℃取出的菌株培养致敏后比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，一般是受体菌应处于对数生长期或生长前期即OD600=0.4~0.7。

③转化鉴定时，42℃准确热休克90s不要振荡，迅速置于冰上2min,按照标准操作步骤进行评估。一般是感受态制备好在-80℃冰箱冻存2天后再做鉴定，更准确评估。

④质粒分子量的大小对转化效率也有影响，一般来说，随着质粒分子量的增大，其转化效率会相应地降低。但当质粒在 4.0kb~7.3kb 时，所得的转化率基本一致。

7、电转感受态制备：

1）准备工作：（提前一天）

1、250ml LB液体盛于1L三角瓶中；

2、1L超纯水；500mL离心管两支；10%甘油400mL；

3、1.5ml离心管和200ul枪头若干

以上物品，120℃灭菌20分钟后置于4℃保存备用

4、电转杯经纯水洗净后这置于75%乙醇浸泡

5、挑ER2738菌单克隆，接种于4mlTet抗性的LB中，于37℃190rpm过夜振荡培养。

2）感受态制备：

1、取前一夜扩增的菌液3ml接种于250mlTet抗性LB中，37℃240rpm振荡培养，约2-3小时OD值可达0.6(其间每1小时测一次OD，其值在0.4-0.8之间均可，但在0.6时效率最好)；

2、将菌液置于冰水混合物中冷浴30分钟。同时将前一夜置于4℃保存的物品取出，置于冰水混合物中冷浴30分钟，同时将离心机预冷到4℃；

3、将菌液全部转入500ml离心管中，2500rpm，4℃离心10分钟；

4、弃上清，向离心管中加入约100ml预冷的无菌水，在冰水混合物中摇晃瓶身，使沉淀充分悬起，然后再补加200ml无菌水，与离心机中4000rpm，4℃下离心10分钟；

5、重复步骤4两次；

6、以10%甘油代替无菌水重复步骤4一次；在离心的过程中将