DNA斑点杂交及残留量测定

(一)制备特异性探针所需要的基本条件 1.被检基因结构清楚; 1.被检基因结构清楚; 被检基因结构清楚 2.有明确的基因产物 有明确的基因产物; 2.有明确的基因产物; 3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少 3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少 某一基因对表型的反应. 某一基因对表型的反应. 具备以上条件之一就可以制备特异性基因 探针. 探针.
DNA分子杂交及相关技术 DNA分子杂交及相关技术
分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性 分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性 DNA 后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合, DNA/RNA通过碱基互补配对结合 后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合, 形成杂种分子的过程. 形成杂种分子的过程. 分子杂交包括:DNA-DNA杂交 DNA杂交, 分子杂交包括:DNA-DNA杂交,DNA-RNA 杂交及蛋白杂交等. 杂交及蛋白杂交等. 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴 定复杂的靶DNA中同源的DNA片段. DNA中同源的DNA片段 定复杂的靶DNA中同源的DNA片段.
(二)特异探针的来源 1,基因组因. 克隆扩增大 量的DNA DNA探针 量的DNA探针
DNA克隆 DNA克隆
2,cDNA 中筛查和分离目的基因探针. 中筛查和分离目的基因探针.
(10)TE缓冲液(pH8.0) 量取lmol/L (10)TE缓冲液(pH8.0) 量取lmol/L Tris 缓冲液 (pH8.O)10ml,0.5mol/L乙二胺四乙 溶液 (pH8.O)10ml,0.5mol/L乙二胺四乙 酸二钠溶液(pH8.0)2ml (pH8.0)2ml, 酸二钠溶液(pH8.0)2ml,加灭菌水至 1000ml. 1000ml. (11)l%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA (11)l%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA DNA 0.10g, 10ml量瓶中 量瓶中, TE缓冲液溶解 0.10g,置10ml量瓶中,用TE缓冲液溶解 并稀释至度,摇匀, 并稀释至度,摇匀,用7号针头反复抽打 以剪切DNA成为小分子,分装后贮藏于DNA成为小分子 以剪切DNA成为小分子,分装后贮藏于20℃备用 备用. 20℃备用. (12)DNA稀释液 鱼精DNA溶液50ul DNA溶液50ul, (12)DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50ul, TE缓冲液至10ml. 缓冲液至10ml 加TE缓冲液至10ml.
将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调 整为每lml1 个细胞,如果为细菌, 整为每lml1×107个细胞,如果为细菌, 则将其浓度调整为每lml lml含 个细胞. 则将其浓度调整为每lml含1×108个细胞. 取悬液lml 离心, lml, 取悬液lml,离心,在沉淀中加裂解液 400ul混匀 37℃作用12～24小时后 混匀, 作用12 小时后, 400ul混匀,37℃作用12～24小时后,加 入饱和酚溶液450ul剧烈混合, 450ul剧烈混合 入饱和酚溶液450ul剧烈混合,以每分钟 10000转离心10分钟 转移上层液体, 转离心10分钟, 10000转离心10分钟,转移上层液体,以 饱和酚溶液450ul重复抽提一次; 450ul重复抽提一次 饱和酚溶液450ul重复抽提一次;转移上 层液体加入三氯甲烷450u1 剧烈混Байду номын сангаас, 450u1, 层液体加入三氯甲烷450u1,剧烈混匀, 以每分钟10000转离心10分钟; 10000转离心10分钟 以每分钟10000转离心10分钟;
Southern Blot
(二) 斑点杂交
(dot and slot hybridization)
1,原理及步骤: 原理及步骤: 提取T 提取T,Cell DNA ↓ 点样品至膜,干燥, 点样品至膜,干燥,固定 ↓ 探针,DNA变性 变性, 探针,DNA变性,杂交 ↓ 洗膜, 洗膜,放射自显影 ↓ 结果分析
二,探针的标记
将探针标记上一种标识物以便杂交后检 测. 常用于标记探针的标识物: 常用于标记探针的标识物: 同位素: dNTP等 同位素:32P , 35S , 3H-dNTP等; 非同位素:地高辛生物素-dNTP. 非同位素:地高辛-dNTP ,生物素-dNTP. 常用的标记方法: 常用的标记方法:
一,杂交探针的获得
是指一段能与目的基因或DNA/RNA片段 是指一段能与目的基因或DNA/RNA片段 DNA/RNA 特异杂交的核苷酸序列. 特异杂交的核苷酸序列. Probe可以是整个基因 可以是整个基因, Probe可以是整个基因,或是基因的一 部分, DNA,也可以是RNA RNA. 部分,是DNA,也可以是RNA.
(6)5.0mol/L氯化钠溶液 (6)5.0mol/L氯化钠溶液 (7)0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液 乙二胺四乙酸二钠溶液(pH (7)0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH 10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至 氢氧化钠溶液调节pH 8.O) 用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至 8.0. 8.0. (8)20%十二烷基硫酸钠(SDS) (SDS)溶液 (8)20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液 用盐 pH至7.2. 酸 pH至7.2. (9)蛋白酶缓冲液 蛋白酶缓冲液(pH8.0) (9)蛋白酶缓冲液(pH8.0) 量取 lmol/LTris溶液1.0ml(pH8.O), 溶液1.0ml(pH8.O) lmol/LTris溶液1.0ml(pH8.O),5.0mol/L 氯化钠溶液2.0ml 0.5mol/L乙二胺四乙 2.0ml, 氯化钠溶液2.0ml,0.5mol/L乙二胺四乙 酸二钠溶液(pH8.0)2.0ml,20% SDS溶液 酸二钠溶液(pH8.0)2.0ml, SDS溶液 (pH8.0)2.0ml ml,加灭菌水至10ml 10ml. 2.5 ml,加灭菌水至10ml.
双链probe或DNA解链,主要取决于: 双链probe或DNA解链,主要取决于: probe 解链 1,链的长度:链越长,需要的能量多才 链的长度:链越长, 能解链; 能解链; 碱基成分:GC含量高 较难变性; 含量高, 2,碱基成分:GC含量高,较难变性; 化学环境:单价阳离子稳定双链, 3,化学环境:单价阳离子稳定双链,甲 酰胺, 酰胺,尿素破坏双链
随机引物标记探针
DNA
32p-dNTP,Bio-DNTP dNTP,Bio-
地高辛-dNTP, 地高辛-dNTP,6bp primer
变性 Klenow, Klenow,dNTP
3` 5` 5`
5` 3`
DNA杂交常用的方法 三,DNA杂交常用的方法
(一)Southern blot
1975年 英国科学家Southern首创, 1975年,英国科学家Southern首创,是指 Southern首创 DNA-DNA杂交 是经典的基因分析方法. 杂交, DNA-DNA杂交,是经典的基因分析方法. 原理和步骤: 1,原理和步骤: 提取Tissue 提取Tissue ,Cell DNA DNA片段 限制性内切酶消化 DNA片段 电泳分离 变性转移至硝酸纤维素膜 变性, 变性,杂交 洗膜,放射自显影, 洗膜,放射自显影,结果分析
Nick Translation
32P-dNTP
DNA
DNA酶 dNTP ,DNA酶I, DNA聚合酶 聚合酶I DNA聚合酶I
OH
BioBio-dNTP 地高辛地高辛-dNTP
p
OH+
P
P
2,随机引物法(6核苷酸引物标记法) 随机引物法( 核苷酸引物标记法) 原理及过程:利用E.coli DNA聚合酶 聚合酶I 原理及过程:利用E.coli DNA聚合酶I的 Klenow亚单位 亚单位, Klenow亚单位,合成含有标记核苷酸的 DNA链 Klenow具有5'→3'聚合酶活性 具有5'→3'聚合酶活性. DNA链.Klenow具有5'→3'聚合酶活性. 被标记的DNA 探针)变性成单链, DNA( 被标记的DNA(探针)变性成单链,引物 与模板结合. Klenow的催化下 的催化下, 与模板结合.在Klenow的催化下,以引物 3'端为起点 沿模板3'→ 5'方向合成 端为起点, 3'端为起点,沿模板3'→ 5'方向合成 DNA新链 反应体系中含有标记的dNTP, 新链. dNTP,随 DNA新链.反应体系中含有标记的dNTP,随 机掺入新合成的DNA链中,探针即被标记. DNA链中 机掺入新合成的DNA链中,探针即被标记.
Translation) 1,缺口平移法 (Nick Translation) 原理及过程: 原理及过程: 反应体系中DNA DNA酶 随机在探针DNA DNA上打开 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开 缺口,然后利用DNA聚合酶I 5'→ 3' 缺口,然后利用DNA聚合酶I DNA聚合酶 外切酶活性,在缺口处按5'→ 3'方向 外切酶活性,在缺口处按5'→ 3'方向 切除单核苷酸;同时DNA聚合酶I DNA聚合酶 切除单核苷酸;同时DNA聚合酶I有5'→ 3'的聚合酶活性 在缺口处3' 的聚合酶活性, 3'端加入 3'的聚合酶活性,在缺口处3'端加入 底物中的单核苷酸, 底物中的单核苷酸,弥补缺口处的核苷 酸链.随着反应的进行底物中被标记单 酸链. 核苷酸,并被随机掺入.DNA聚合酶 聚合酶I 核苷酸,并被随机掺入.DNA聚合酶I的 两种作用交替进行,探针即被标记. 两种作用交替进行,探针即被标记.
3,寡核苷酸探针 根据已知基因序列,人工合成一段互补的DNA 根据已知基因序列,人工合成一段互补的DNA 片段.一般长约15 50个bp. 15～ 片段.一般长约15～50个bp.多数探针的制 备都通过分子克隆的方法获得. 备都通过分子克隆的方法获得. 克隆(clone):是指用无性繁殖的方法获得 克隆(clone) 同一个体,细胞或分子的大量复制品. 同一个体,细胞或分子的大量复制品.
试剂: 试剂: (1)DNA标记和检测试剂盒 (1)DNA标记和检测试剂盒 (2)DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜 杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜. (2)DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜. (3)2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g, (3)2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g, 溶于灭菌水10ml 10ml中 分装后储藏于溶于灭菌水10ml中,分装后储藏于-20℃ 备用. 备用. (4)3% (4)3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白 蛋白0.30g 溶于灭菌水10ml 0.30g, 10ml中 蛋白0.30g,溶于灭菌水10ml中. (5)1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液 三羟甲基氨基甲烷(Tris) (5)1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液 用盐酸调pH值至8.0 pH值至8.0. (pH8.0) 用盐酸调pH值至8.0.
用于探针标记和阳性对照的DNA制备 制备 用于探针标记和阳性对照的 用于探针标记和阳性对照的DNA, 用于探针标记和阳性对照的 , 由生产供试品用的传代细胞, 由生产供试品用的传代细胞,工程菌或 杂交瘤细胞提取纯化获得, 杂交瘤细胞提取纯化获得,其提纯和鉴 定可参考下述推荐方案进行, 定可参考下述推荐方案进行,具体方法 可参考《分子克隆实验指南([美 萨姆布 可参考《分子克隆实验指南 美]J.萨姆布 鲁克等著,黄培堂等译, 鲁克等著,黄培堂等译,科学出版利 2002)或《精编分子生物学实验指南》 或 精编分子生物学实验指南》 ([美]F.奥斯伯等著,颜子颖,王海林译, 奥斯伯等著, 美 奥斯伯等著 颜子颖,王海林译, 科学出版社,1998). 科学出版社, .
DNA 样品
点样
Probe-32P
检测
A B 1 2 3 4
附录ⅨB 外源性DNA 附录ⅨB 外源性DNA残留量测定法 DNA残留量测定法
供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸 供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸 DNA 附于固相膜上, 附于固相膜上,在一定温度下可与相匹配 的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA DNA复性而重新结合成为双链DNA, 的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA, 称为杂交.将特异性单链DNA探针标记后, DNA探针标记后 称为杂交.将特异性单链DNA探针标记后, 与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交, DNA杂交 与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交, 并使用与标记物相应的显示系统显示杂交 结果,与已知含量的阳性DNA对照比对后, DNA对照比对后 结果,与已知含量的阳性DNA对照比对后, 可测定供试品中外源性DNA的含量. DNA的含量 可测定供试品中外源性DNA的含量.