核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究

核 糖 核 酸 酶 Ｏｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ的 稀 释 复 性 条 件 优 化 研 究
郭 红 ， 徐 殿胜 。 王庆 诚 （ １ ． 华 东理工 大 学 生物反 应器 工程 国家重 点 实验 室， 上海 ２ ０ ０ ２ ３ ７ ；
２ ． 上 海 南方 模 式 生 物 研 究 中 心 ， 上海 ２ ０ １ ２ １ ０ ）
Ｄ Ｉ Ｂ Ｂ缓 冲溶 液 ： ２ ０ ｍｍｏ ｌ ・ Ｌ ＿ 。 Ｔｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ ， ６ ｍｏ ｌ
・
０ｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ （ 豹蛙 酶 ） 是 一 种 从 北 极 豹 蛙 卵母 细 胞 和早期 胚胎 中提取 的核 糖核 酸 酶 ， 对人 肺 腺癌 细胞 、 慢
Ｌ ～Ｇ ｕ ａ ｎ ｉ ｄ ｉ ｎ ｅ — ＨＣ １ ， ６ ５ ｍｍｏ ｌ ・ Ｌ － １ Ｄ ＴＴ（ 现加 ） ， １ ０
４℃ 、 采 用最 佳 复 性 体 系（ 先加 Ｇ Ｓ Ｓ Ｇ的含 ２ ｍｏ ｌ ・ Ｌ 尿 素的稀释复性缓 冲溶液） 时， 复 性纯化后 Ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ 含 量 和 回 收
率 明显 高 于醋 酸 沉 淀 复 性 法 。
关键词 ： 核糖核 酸酶； 包 涵体 ； 稀释复性 ； 分 离纯化
在 内含 Ｏｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ 包 涵体 的大 肠杆 菌 发 酵液 中加 入溶菌 酶 ， 匀浆破 碎 ， 于６ ０ ０ ０ ｒ・ ｍｉ ｎ 离心 ｌ ｈ ； 加人 Ｔ Ｅ Ｓ缓 冲溶液及 ２ ５ Ｔｒ ｉ ｔ ｏ ｎ Ｘ － Ｉ Ｏ ０ ， 匀浆后 再于 ６ ０ ０ ０ ｒ ・ ａｉ ｒ ｎ 离心 １ ｈ ， 重 复操作 １ 次； 再 加入 Ｔ Ｅ Ｓ缓 冲溶 液， 匀浆， 于６ ０ ０ ０ ｒ・ ｍｉ ｎ 离心 １ ｈ ， 重 复操 作 直至 上
也 有意 想不 到的效果 ， 因此 ， 在 复性 缓 冲溶 液 中加 入
一
定 量的 ＧＳ Ｓ Ｇ和尿 素 ， 并 考察 了复性 温度 、 尿素 浓度 、
Ｇ Ｓ Ｓ Ｇ加入 时间对 复性效 果 的影 响 ， 以确 定 最优 稀释 复
性条 件 ， 并与传统 的醋 酸沉淀复性 法 进行 了对 比。拟为 Ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ 生产工业化 、 提高 Ｏｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ 产量提供 帮助 。
的重 新形 成起 到很 重要 的作 用 ， 尿 素 对 蛋 白质 的 复性
Ｄ Ｂ缓 冲溶 液 ： ２ ０ ｍｍｏ ｌ ・ Ｌ 乙酸 。
多功 能 酶标仪 （ Ｂ Ｉ ＯＴ Ｅ Ｋ） ， ＡＫＴ Ａ Ｐ ｕBaidu Nhomakorabeaｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｒ （ Ｇ Ｅ） 。
１ ． ２ 方 法
１ ． ２ ． １ 菌体 破碎 及包 涵体 的洗 涤
目的 ［ 。
Ｉ Ｃ Ｉ ＮＣ ） ， Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎ Ｘ － Ｉ Ｏ ０ 、 Ｇ Ｓ Ｓ Ｇ（ Ａｍｒ ｅ ｓ ｃ ｏ ） 等。 Ｔ Ｅ Ｓ缓 冲 溶 液 ５ Ｏ ｍｍｏ ｌ・Ｌ 。 。Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ ， ２ ０
ｍｍｏ ｌ ・ Ｌ 一 １ Ｅ Ｄ ＴＡ， １ ０ ０ ｍｍｏ ｌ ・ Ｌ ＿ 。 Ｎａ Ｃ １ ， ｐ Ｈ 值８ ． ０ 。
ｍｍｏ ｌ ・ Ｌ＿ 。 Ｎａ Ｃ １ ， ３ ． ０ ｍｍｏ ｌ ・Ｌ 还 原型 谷 胱甘 肽 ，
０ ． ６ ｍｍｏ ｌ ・Ｌ 氧化 型谷 胱甘 肽 ， ｐ Ｈ值 ８ ． ０ 。
目前 ， 国内多通 过 毕 赤酵 母 和 大 肠 杆 菌 发酵 来 制 备 Ｏｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ 。作者 在 此 先 提 纯 大 肠 杆 菌发 酵 获 得 的 包 涵体 ， 再使 包 涵体 复 性 得 到 有 活 力 的 Ｏｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ蛋 白。 由于氧化 型谷胱 甘 肽 （ ＧＳ Ｓ Ｇ） 对 蛋 白质 中二硫 键
亿 学 与 壁 物 互程 ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ Ｉ ． ３ ０ Ｎ ｏ ． １ ０
Ｃｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ＆ Ｂｉ ｏ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ
团
ｄ ｏ ｉ ： ｌ Ｏ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ２ －５ ４ ２ ５ ． ２ ０ １ ３ ． １ ０ ． ０ １ ５
摘 要 ： 采 用稀 释 复性 方 法从 包涵 体 中复 性 得 到 有 活 力 的 ０ ｎ ｃ ｏ ｎ ａ ｓ ｅ蛋 白 ， 并 与 传 统 的 醋 酸 沉 淀 复 性 方 法 进 行 了比 较， 考 察 了 复性 温 度 、 尿素浓度 、 氧 化型 谷胱甘 肽 （ Ｇ Ｓ Ｓ Ｇ） 加 入 时间对复性 效 果 的影响 。结果表 明 ， 在 最 佳 复性 温 度 为
中图 分 类 号 ： Ｑ ５ ｎ 文 献 标 识 码 Ａ 文 章 编 号 １ ６ ７ ２ —５ ４ ２ ５ （ ２ ０ １ ３ １ １ Ｏ 一０ ０ ５ ７ —０ ４
核糖核 酸酶是 一 类 广泛 存 在 于 动 植 物 体 内的 、 具 有 水解 作用 的一类 酶 。它通 过剪 切转 录 核糖核 酸及对 核 糖 核酸进 行修饰 和 降解来 达到 抑制 肿 瘤细胞 生 长的
ｍｍｏ １ ． Ｌ ～ Ｅ ＤＴ Ａ， ｐ Ｈ值 ８ ． ０ 。
性粒 细胞 白血病 细胞 、 黑 色 素瘤 细 胞 及 人 体肺 腺 癌 上
皮细 胞等 都 有 细 胞 毒 性 作 用 ［ ２ ］ ， 是 一 种 具 有 很 大 开 发潜 力 的蛋 白质 。
Ｒ Ｂ缓 冲 溶 液 ： １ ０ ０ ｍｍｏ ｌ ・Ｌ — Ｔ ｒ ｉ ｓ — Ａｃ ＯＨ， １ ０ ０
清液 澄清 ， 得到 包涵 体 。 １ ． ２ ． ２ 包 涵体 蛋 白 的溶 解 和稀释 复性 将包 涵体 溶 解 于 一 定 体 积 的 ＤＩ Ｂ Ｂ缓 冲溶 液 中，
室 温振荡 过 夜 。测 定 蛋 白含 量 后 ， 用 ＤＩ Ｂ Ｂ缓 冲溶 液 将 蛋 白质 浓度 稀 释到 １ ０ ｍｇ・ ｍＬ ＿ 。 。