RNA病毒的检测
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第一章 RNA的提取和cDNA的合成 RNA的提取和cDNA的合成 的提取和cDNA
RT-PCR原理 RT-PCR原理
提取总RNA 提取总RNA 以其中的mRNA作为模板 以其中的mRNA作为模板 mRNA 反转录 cDNA 作模板 PCR 获得目的基因
一、RNA的提取 RNA的提取
RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA 易降解 酶的污染，并设法抑制其活性。 酶的污染，并设法抑制其活性。 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人 酶稳定 的皮肤、手指、试剂、容器等。 的皮肤、手指、试剂、容器等。
二、PCR反应中的主要成分 PCR反应中的主要成分
引物：好坏是PCR成败的关键。 引物：好坏是PCR成败的关键。 PCR成败的关键 设计原则： 设计原则： 1、引物长度约为16-30bp。 引物长度约为16-30bp。 16 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的 引物中G+C含量通常为40%-60%， G+C含量通常为40% 解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 Tm 72℃最好 3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C， 四种碱基应随机分布， 3'端不存在连续3 端不存在连续 因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。 因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。 G+C富集序列区引发错误
2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶 鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶 (M 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 37℃ 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性， 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性， RNA和依赖于DNA 合成活性 但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱， 但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱， RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱 且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 AMV反转录酶差 MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2 3kb)。 M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。 反转录酶能合成较长的cDNA(如大于
（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是 异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀， RNA 容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA DNA和大分子rRNA和 容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和 mRNA， 5sRNA、tRNA不产生沉淀 所以RNA 不产生沉淀， mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA 电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚， 5sRNA带很不清楚 电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必 是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 RNA降解 是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 因为上述试剂会影响后续实验，所以用75% 75%乙 （4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙 醇洗1 醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的 有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿， 有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥 痕量的乙醇很容易挥发掉。 发，痕量的乙醇很容易挥发掉。
注意事项： 注意事项：
1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 与氨水溶液混合会产生致癌物 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和 能与氨基和巯基反应 Tris （二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 DEPC处理 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 DEPC 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。
PCR的原理： PCR的原理： 的原理
体外DNA 体外DNA复制 DNA复制
包括高温变性、 包括高温变性、 低温退火和中温 延伸过程。 延伸过程。
一、PCR基本步骤 PCR基本步骤
三个步骤： 三个步骤： 1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。 变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。 (Denature) DNA目的片段在94℃下解链 2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃ 退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃ (Anneal) 左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 延伸(Extension) (Extension)： DNA聚合酶合成DNA的最 聚合酶合成DNA 3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最 适温度(72℃左右) 适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。 (72℃左右 以目的DNA为模板进行合成。 DNA为模板进行合成
Yeast Total RNA
二、cDNA的合成 cDNA的合成
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 RNA 种类：两种 种类： 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 禽类成髓细胞病毒（AMV） 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 42℃ 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 RNA 合成 DNA DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA 进行内切降解(RNA酶 活性) 进行内切降解(RNA酶H活性)。 (RNA
总RNA提取方法（试剂盒）： RNA提取方法（试剂盒）： 提取方法
异硫氰酸胍－苯酚法（ 异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理： 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂 Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释 解细胞，使细胞中的蛋白、 酚是有效的蛋白变性剂 蛋白变性剂， 放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制 RNA酶活性 因此Trizol中还加入了8 羟基喹啉、 酶活性， Trizol中还加入了 RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、 异硫氰酸胍、 异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。 RNase。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白 属于解偶剂 质变性剂，可溶解蛋白质， 质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
3、特异性引物 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物， RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物 此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的 此类引物仅产生所需要的cDNA， cDNA PCR扩增。 PCR扩增。 扩增
第二章 聚合酶链式反应 （PCR） ）
* PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase chain PCR，即聚合酶链式反应（ reaction） 是一种对特定的DNA reaction）, 是一种对特定的DNA片段在体外进行快 DNA片段在体外进行快 速扩增的方法。 速扩增的方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得 1985年穆里斯 年穆里斯（ Mullis）发明， 了1993年的诺贝尔化学奖。 1993年的诺贝尔化学奖。 年的诺贝尔化学奖
4、引物3'-端最好与目的序列阅读框架中密码子第 引物3'3' 一或第二位核苷酸对应， 一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆 动产生的不配对。 动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 3‘ 且3’-端尽量不用A，尤应避免连续2个或2个以 3’-端尽量不用A 尤应避免连续2个或2 上A，因为A引发错配的几率高；最好选择T。 因为A引发错配的几率高；最好选择T
6、两引物之间尤其在3'-端不能互补，以防出现 两引物之间尤其在3'-端不能互补， 3' 引物二聚体，减少产量。 引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。 个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物 引物5'-端对扩增特异性影响不大， 5' 设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、 设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起 始密码子、缺失或插入突变位点等， 始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在 5'-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 5'-端限制酶位点外再加1 个保护碱基。
cDNA引物 cDNA引物 种类： 种类： 1、随机引物：不特异的引物 随机引物： 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板， 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板， RNA分子全部充当了cDNA第一链模板 PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。 PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性 常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 cDNA 来源于rRNA
采取的措施： 采取的措施：
1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换 （使用一次性手套）。 使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 200℃ 烤2h以上。 2h以上。 以上 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂 不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 DEPC
2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 mRNA 绝大多数真核细胞mRNA具有3’- Poly(A)尾 绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引 mRNA具有3’ 物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 12-18核苷酸）与其配对， mRNA可被反转录。 核苷酸 可被反转录 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的 4%， 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成 Poly(A)RNA仅占总RNA 的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方 cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方 比随机引物得到的cDNA 面均要小。 面均要小。
（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主 氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。 可使蛋白变性 要作用是分相 实际上是加速有机相和水相的分 分相， 要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分 上层水相， 5.1左右 当溶液pH 左右， pH在酸性的 层。上层水相，pH 5.1左右，当溶液百度文库H在酸性的 时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面 分子就会沉淀在酚与溶液的界面， 时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只 RNA分子留在水相 而当pH接近中性时， 分子留在水相。 pH接近中性时 有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA 就会溶解在水相，（导致pH ，（导致pH中性的原因可能是 就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是 trizol与样品比例不对 与样品比例不对， trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前 提下使trizol过量）。同时， trizol过量）。同时 提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶 液中的痕量的酚。 液中的痕量的酚。
RT-PCR原理 RT-PCR原理
提取总RNA 提取总RNA 以其中的mRNA作为模板 以其中的mRNA作为模板 mRNA 反转录 cDNA 作模板 PCR 获得目的基因
一、RNA的提取 RNA的提取
RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA 易降解 酶的污染，并设法抑制其活性。 酶的污染，并设法抑制其活性。 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人 酶稳定 的皮肤、手指、试剂、容器等。 的皮肤、手指、试剂、容器等。
二、PCR反应中的主要成分 PCR反应中的主要成分
引物：好坏是PCR成败的关键。 引物：好坏是PCR成败的关键。 PCR成败的关键 设计原则： 设计原则： 1、引物长度约为16-30bp。 引物长度约为16-30bp。 16 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的 引物中G+C含量通常为40%-60%， G+C含量通常为40% 解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 Tm 72℃最好 3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C， 四种碱基应随机分布， 3'端不存在连续3 端不存在连续 因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。 因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。 G+C富集序列区引发错误
2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶 鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶 (M 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 37℃ 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性， 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性， RNA和依赖于DNA 合成活性 但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱， 但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱， RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱 且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 AMV反转录酶差 MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2 3kb)。 M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。 反转录酶能合成较长的cDNA(如大于
（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是 异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀， RNA 容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA DNA和大分子rRNA和 容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和 mRNA， 5sRNA、tRNA不产生沉淀 所以RNA 不产生沉淀， mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA 电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚， 5sRNA带很不清楚 电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必 是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 RNA降解 是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 因为上述试剂会影响后续实验，所以用75% 75%乙 （4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙 醇洗1 醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的 有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿， 有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥 痕量的乙醇很容易挥发掉。 发，痕量的乙醇很容易挥发掉。
注意事项： 注意事项：
1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 与氨水溶液混合会产生致癌物 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和 能与氨基和巯基反应 Tris （二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 DEPC处理 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 DEPC 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。
PCR的原理： PCR的原理： 的原理
体外DNA 体外DNA复制 DNA复制
包括高温变性、 包括高温变性、 低温退火和中温 延伸过程。 延伸过程。
一、PCR基本步骤 PCR基本步骤
三个步骤： 三个步骤： 1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。 变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。 (Denature) DNA目的片段在94℃下解链 2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃ 退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃ (Anneal) 左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 延伸(Extension) (Extension)： DNA聚合酶合成DNA的最 聚合酶合成DNA 3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最 适温度(72℃左右) 适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。 (72℃左右 以目的DNA为模板进行合成。 DNA为模板进行合成
Yeast Total RNA
二、cDNA的合成 cDNA的合成
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 RNA 种类：两种 种类： 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 禽类成髓细胞病毒（AMV） 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 42℃ 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 RNA 合成 DNA DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA 进行内切降解(RNA酶 活性) 进行内切降解(RNA酶H活性)。 (RNA
总RNA提取方法（试剂盒）： RNA提取方法（试剂盒）： 提取方法
异硫氰酸胍－苯酚法（ 异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理： 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂 Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释 解细胞，使细胞中的蛋白、 酚是有效的蛋白变性剂 蛋白变性剂， 放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制 RNA酶活性 因此Trizol中还加入了8 羟基喹啉、 酶活性， Trizol中还加入了 RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、 异硫氰酸胍、 异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。 RNase。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白 属于解偶剂 质变性剂，可溶解蛋白质， 质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
3、特异性引物 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物， RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物 此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的 此类引物仅产生所需要的cDNA， cDNA PCR扩增。 PCR扩增。 扩增
第二章 聚合酶链式反应 （PCR） ）
* PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase chain PCR，即聚合酶链式反应（ reaction） 是一种对特定的DNA reaction）, 是一种对特定的DNA片段在体外进行快 DNA片段在体外进行快 速扩增的方法。 速扩增的方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得 1985年穆里斯 年穆里斯（ Mullis）发明， 了1993年的诺贝尔化学奖。 1993年的诺贝尔化学奖。 年的诺贝尔化学奖
4、引物3'-端最好与目的序列阅读框架中密码子第 引物3'3' 一或第二位核苷酸对应， 一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆 动产生的不配对。 动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 3‘ 且3’-端尽量不用A，尤应避免连续2个或2个以 3’-端尽量不用A 尤应避免连续2个或2 上A，因为A引发错配的几率高；最好选择T。 因为A引发错配的几率高；最好选择T
6、两引物之间尤其在3'-端不能互补，以防出现 两引物之间尤其在3'-端不能互补， 3' 引物二聚体，减少产量。 引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。 个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物 引物5'-端对扩增特异性影响不大， 5' 设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、 设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起 始密码子、缺失或插入突变位点等， 始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在 5'-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 5'-端限制酶位点外再加1 个保护碱基。
cDNA引物 cDNA引物 种类： 种类： 1、随机引物：不特异的引物 随机引物： 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板， 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板， RNA分子全部充当了cDNA第一链模板 PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。 PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性 常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 cDNA 来源于rRNA
采取的措施： 采取的措施：
1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换 （使用一次性手套）。 使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 200℃ 烤2h以上。 2h以上。 以上 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂 不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 DEPC
2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 mRNA 绝大多数真核细胞mRNA具有3’- Poly(A)尾 绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引 mRNA具有3’ 物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 12-18核苷酸）与其配对， mRNA可被反转录。 核苷酸 可被反转录 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的 4%， 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成 Poly(A)RNA仅占总RNA 的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方 cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方 比随机引物得到的cDNA 面均要小。 面均要小。
（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主 氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。 可使蛋白变性 要作用是分相 实际上是加速有机相和水相的分 分相， 要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分 上层水相， 5.1左右 当溶液pH 左右， pH在酸性的 层。上层水相，pH 5.1左右，当溶液百度文库H在酸性的 时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面 分子就会沉淀在酚与溶液的界面， 时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只 RNA分子留在水相 而当pH接近中性时， 分子留在水相。 pH接近中性时 有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA 就会溶解在水相，（导致pH ，（导致pH中性的原因可能是 就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是 trizol与样品比例不对 与样品比例不对， trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前 提下使trizol过量）。同时， trizol过量）。同时 提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶 液中的痕量的酚。 液中的痕量的酚。