发酵工程-第五章-发酵工业种子制备

种子制备过程

实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养

生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
实验室种子制备

无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
种子制备的放大原理与技术

细菌发酵时的种子扩大培养；
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是 为了获得大量的活力强的种子 ；
种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物 含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期

举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序


菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法
不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下活化即可


种子扩大培养阶段

液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。


生产车间种子制备
落实什么？


制定完善相应的操作规程，技能操作从零 开始培训。 一切行为模式化、标准化，科研需要发挥 主观能动性，前提是严谨细致的操作
人员
怎么保证落实？ 负责人加强监督检查、管理， 随机现场考核对于不规范行为追究问责， 纳入考核 出现异常相关人员需做出书面分析
设备

设备管理：主要仪器、设备建立SOP，及 时填写仪器使用及维保记录、设备运行日 常维保定期维保等，明确培养箱、液相、 紫外、天平、pH计等主要仪器设备的校验 周期并按时校准。
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在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
影响种子质量的因素

原材料质量
培养温度
斜面冷藏时间 培养基 pH
湿度
通气与搅拌
原材料质量

原材料质量波动引起种子质量不稳定 原材料质量波动的主要原因：无机离子 含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
培养基

培养种子的目的：

扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性 高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点

有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大；

各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
种子质量的判断方法

通常检测的培养液中参数

pH是否在种子要求的范围之内


糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染

其他参数，如接种前酶活、种子罐的 溶氧和尾气等
种子制备

步骤：

斜面培养基中活化；

扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培
养，完成实验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； 种子转种至发酵罐
目的：
稳定是实验的前提条件

规范实验操作，保证摇瓶实验 的数据靠性，最大程度的降低 偏差出现的风险，尽可能保证 摇瓶工艺的可重复性。
2.内容(Content)
人员
设备
物料 方法
环境
人员
人始终是第一要素，所有问题最终都会落到人的 问题上，如何能控制人的问题？
我们的目标 —落实就是工作的全部
人员
设备
计量器具：计量器具选型合适，量度和 精确度满足要求 反应容器具：发酵摇瓶选型恰当，规格 统一，即使是同一批次的三角瓶，不同 个体间规格（瓶口口径等）差异也较大 所以使用前要进行筛选。
设备
瓶塞：瓶塞（纱布、海绵塞、棉塞、牛 皮纸等）通气性均一，及时淘汰更新。
搅拌器：磁力搅拌器、搅拌转子的选择 要保证搅拌效果。

实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子 罐进行扩大培养 种子罐培养一获得足够的菌种数量，二 种子 罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养 条件，使菌体适应发酵环境


种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及 减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
有利于减少染菌机会
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
接种种龄和接种量

接种量：移入的种子液体积和接种后培养液 体的体积的比例

接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰 老细胞增加等，发酵后劲不足
种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而 且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
通气与搅拌

足够的通气量，以保证菌种代谢正 常，提高种子的质量 搅拌可提高通气效果，促进生长繁 殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过 多增加染菌机会，增加能耗。 丝状微生物不宜剧烈搅拌。


斜面冷藏时间

对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
物料

菌种：菌种是发酵最关键的起始物料， 种子（菌种库、斜面、平板、种子液） 质量的控制要严格，前期研究要全面透 彻，能检测的点尽可能多检测（pH、生 物量、糖、氮、镜检等），明确不同种 龄、生长状态对发酵单位的影响程度。 每次接种发酵摇瓶时都要加强种子质量 的检测并记录。接种操作尽量选择移液 器，保证接种量一致。

pH

选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的pH应 接近于发酵培养基的pH，以便种子 能尽快适应新的环境

种子质量的控制措施

菌种稳定性的检查

测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并 及时对退化菌种进行复壮

提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵。
丝状真菌的菌丝体作为接种物

不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作 为接种物，如生产赤霉素的菌种—— 藤仓赤霉

问题：难以获得均一的接种物
接种前将菌丝打成碎片，形成大量的 菌丝段，它具有大量的生长点
放线菌发酵时的种子扩大培养

斜面培养，制备孢子悬浮液作初级 种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子

培养温度

温度过低，菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨 基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿度

湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少

种龄与接种量
接种龄
种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。

大量地接入培养成熟的菌种的优点：

缩短生长过程的延缓期，因而缩短了
发酵周期，提高了设备利用率


节约发酵培养的动力消耗
酵母发酵时的种子扩大培养

酿酒酵母的扩大培养

最初采用纯种进行酵母发酵并设计出 酵母繁殖流程，他将每一步的接种量 规定为10％，并控制繁殖条件与酿造 时一致
现代的流程中，接种量为1%或更低， 控制的条件也与酿造时不同。

面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以
利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐 进行发酵
利用孢子作为接种物

在固化的培养基上产生孢子
“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产
在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子

在液体深层培养基中产生孢子
灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％ （w/v）之间时，可以产生大量的孢子