乙肝丙肝核酸检测的新平台(临床)

关键的 HBV-DNA测试 N/A 杂交研究解决方案 1 Amplicor Monitor 2 Cobas Amplicor 3 Cobas Amplicor 4 Cobas Amplicor 5 Cobas TaqMan 6
Lamivudine
Adefovir dipivoxil
阿德福韦酯 恩替卡韦
• HBV 治疗的路线图理念，为HBV DNA监测用于临床实践提 供了指导
• 对用药耐药性的监测（拉米夫定－YMDD，„）
• 肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）
• „„
HBV DNA监测的临床应用
HBV治疗路线图
Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志
乙肝丙肝核酸检测的新平台 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 全自动荧光定量分子诊断系统
——顾 剑
罗氏分子诊断
罗氏分子诊断
一直以来，罗氏分子诊断对临床 核酸检测市场提供完善可靠和创 新性的产品及解决方案
COBAS TAQMAN 96
自动化程度
COBAS AMPLIPREP
COBAS AMPLICOR MONITOR COBAS AMPLICOR MWP
定量原理
外标法定量（国产试剂）
• 使用一组（4管）外部标准品定量，分别为5×104到5×107 IU/mL • 未考虑各患者血液成分间的差异性对结果的影响
定量原理
内标定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM)
HCV病毒检测阴性 继续治疗至24周
HCV RNA下降<2log 考虑停药
HCV病毒检测 阳性 继续治疗至48周
国产试剂现状
• 目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：
• HCV试剂盒说明：500～5×107 IU/mL
• 较可信的测试范围：104～5×107 IU/mL
注：1 IU/mL= 1 copy/mL
•
• • •
HBV的定量检测性能指标
国产HBV试剂
CAP/CTM HBV
灵敏度 (LOD)
检测范围
500 IU/mL？
104～5×107 IU/mL
12 IU/mL
54 - 1.1×108 IU/mL
定量方法
其它
外标法定量 对部分发生HBV病毒突变 的病人无法准确检测
内标法定量 涵盖亚型: A-G 加强pre-core突变检测
COBAS TAQMAN 48
•标准化 •自动化 •重复性
2001 2003 2006
1992
1996
1998
目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题
• 治疗终点无法准确判定
• 有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临 床症状依然明显
• 不能及时预测耐药（病毒学突破）
• 核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下， 不久却发现病毒出现反跳
通用名 Interferon alfa-2b
α-2b 干扰素 拉米夫定
商品名 INTRON® A EPIVIR-HBV® HEPSERA™ BARACLUDE™ PEGASYS® TYZEKA™ VIREAD (HIV)
FDA 批准日期 1991 1998 2002 2005 2005 2006 Phase 3
• 检测通量可达4*24测试 • 独立的24孔热循环仪 • TaqMan 48有2个模块，TaqMan 96有4个模块 • 最多可同时进行4个不同的分析检测 • 操作简单，核酸扩增和检测全部自动完成 • 实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏 度高和特异性好，动态范围宽
HBV-DNA定量测试用于药品FDA注册试验
• 疗效的准确监测？？？
• 治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后
问题的根源在哪里？
内 容
• HBV核酸检测的现状与需要
• HCV核酸检测的现状与需要 • 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 • 总结
HBV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用
• HBV DNA是监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物
Entecavir Peginterferon alfa-2a
聚乙二醇干扰素α-2a
Telbivudine
替比夫定 替诺福韦
Tenofovir
INTRON® A (Interferon alfa-2b) [package insert]. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV® (Lamivudine) [package insert] GlaxoSmithKline, Research Triangle park, NC 3. HEPSERA™ (Adefovir dipivoxil) [package insert] Gilead Sciences. Foster City, CA 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) [package insert]. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TYZEKA™ (Telbivudine) [Package Insert]. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HI
国外发表的文献
• • • • • Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, 2008, 15, 392–398 Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology ,2008, 43, 162–168 COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Journal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828–834 Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4) Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al., Journal of Medical Virology 2005, 77:486–490 Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and plasma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virology 2009 Jul;45(3):232-6 Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 274-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Ste´phane Chevaliez et al., Journal of Clinical, May 2008, p. 1716–1723 ……
内 容
• HBV核酸检测的现状与需要 • HCV核酸检测的现状与需要
• 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处
• 总结
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系统
全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统 真正实现 “样品进，结果出” 全球安装超过 2,000台，国内安装超过 40台
注：国产试剂1 IU/mL= 1 copy/mL
HCV的定量检测性能指标
国产HCV试剂
CAP/CTM HCV
灵敏度 (LOD)
检测范围
500 IU/mL？
104～5×107 IU/mL
15 IU/mL
43 – 6.9×107 IU/mL
定量方法
其它
外标法定量
未知
内标法定量 1-6 型 (能区分 0.5 log浓 度变化)
国产试剂现状
• 目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：
• HBV试剂盒说明：500～5×107 IU/mL
• 较可信的测试范围：104～5×107 IU/mL • 对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测
注：1 IU/mL= 1 copy/mL
内 容
• HBV核酸检测的现状与需要
• HCV核酸检测的现状与需要
COBAS AmpliPrep仪器
MGP 磁珠分离技术
1.裂解、稳定和去蛋白
2.核酸捕获
3.冲洗
4.洗脱
DNA 或者 RNA 病毒或细胞
37°C孵育
室温
80°C孵育
CAP机械臂介绍
• 取SPU枪头 • 样本管/反应管管盖抓手 • 样本初始体积感应器 • 取试剂钢针
样本管/反应管结 构
COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析仪简介
COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48®系统
COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96®系统 （无连接系统）
COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96®系统 （带连接系统）
ห้องสมุดไป่ตู้
COBAS AmpliPrep仪器简介
• 全自动系统，自动进行核酸提取纯化和 PCR反应体系配制 • 基于MGP磁珠分离技术，确保高质量的核 酸提取纯化 • 最多72个样品可以同时上机，运行中可连 续装载上架，提高工作效率 • 包括耗材、样品、试剂均可以连续上 样
• 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 • 总结
HCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用
• HCV病毒感染是可治愈的疾病 • HCV RNA检测可以有效指导临床用药 • 治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检测可以直接指导停 药时机）
慢性HCV治疗方案
用药
12周早期病毒学反应
HCV RNA下降>2log 治疗到24周 HCV RNA检测 HCV病毒检测 阴性 停药