电子显微镜技术经典讲义
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一、透射电子显微镜结构和工作原理 二、透射电子显微镜的样本制备技术 三、透射电子显微镜在医学领域的应用
一、TEM结构和工作原理
镜筒
辅助系统
照明系统： 电子枪、聚光镜
成像系统： 样品室、物镜、 中间镜、投影镜
真空系统： 机械泵、油扩 散泵、真空管 道、阀门等
电源系统： 高压电源等
观察记录系统： 观察室、底片室
其他类型: 根据电压分为: 低、中、高压电镜 根据用途分为: 分析电镜、环境电镜
透射电子显微镜－TEM
transmission electron microscopy
扫描电子显微镜－ SEM
Scanning electron microscopy
放大倍率：150万倍 分辨率： 0.1nm
放大倍率：80万倍 分辨率： 0.6nm
肾
120～140
9～10
睾丸
200～220
12～13
肝、胃肠道 160～180
9～10
灌注时一定要注意 压力和速度！
常用的固定剂
预固定： 1.5 % ～5 %戊二醛（0.1M PB配置） 后固定： 1 %锇酸（四氧化锇）水溶液
脱水
目的：指将样品内所含的游离水分完全清除的过程。 (常用的脱水剂为乙醇和丙酮)
二、TEM 的样品制备技术
1. 超薄切片技术 Ultramicrotomy
2. 负染色技术 Negative staining technique
3.免疫电镜技术 Immune Electron Microscopy（IEM）
1. 超薄切片（ultrathin section ）制备技术
超薄切片制备技术 基本操作程序
50% 乙醇 10～15分钟，4℃ 70% 乙醇 10～15分钟，4℃ 80% 乙醇 10～15分钟，4℃ 90% 乙醇 10～15分钟，4℃ 100% 乙醇 10分钟，3次，室温
二次电子（Second electron）
在入射电子的轰击下，样品表面5 ～50nm深度激发出来的电子称为二次电 子，利用二次电子信息成像的称为扫描 电镜。
电镜的基本类型
透射电子显微镜（TEM） Transmission electron microscopy
扫描电子显微镜（SEM） Scanning electron microscopy
取材 脱水 修块
预固定 浸透 切片
后固定 包埋聚合 染色
蜡片
取材
快 在1分钟内固定！ 小 1mm³的小块 轻 不要牵拉、锯、挤压组织 冷 低温操作，4℃保存
为什么？
快 1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为
瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。
小 约1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及
时固定会发生细胞自溶现象。
电子显微镜技术
第一节 电镜的基本理论和分类 第二节 透射电子显微镜 第三节 扫描电子显微镜 第四节 电镜样本的取材
二十世纪最主要的发明之一
55年之后， 1986年获诺贝 尔物理学奖
鲁斯卡(左)和他发明的第一台电镜（1932年）
第一节 电子显微镜的基本理论和分类
电子显微镜镜以电子射线作为照明源， 以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍 率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超 微结构。
轻 不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损
伤。
冷 低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组
织发生自溶。
温度越低越好吗？
－20℃冷冻后
快小
组织未及时固定
轻
牵拉损伤后
轻 血管内皮
预固定
组织块浸泡固定 体内原位固定Biblioteka Baidu 血管灌注固定
常用预固定剂：2 .5% 戊二醛
组织块浸泡固定
取2～3块组织迅速浸泡于固定液中
显微镜的分辨率与波长的关系？（半波长） 光波波长约 0.4 µm，光镜的分辨率？ 电子波长约 0.005 nm，电镜的分辨率？
放大倍率 ＝人眼分辨率÷显微镜分辨率 （magnification）
3.000×
TEM：1000倍～100万倍
50×
SEM：5倍～80万倍
TEM
分辨率 0.1nm
SEM
0.6nm
特别是对脑、心肌、肾脏等对缺 氧比较敏感的组织尤为重要
全身灌注
麻醉后打开胸腔暴露心脏
灌注针头插入左心室
灌注生理盐水后，立即剪开右心房
右心房流出清亮液体， 不含血液时再灌注固定液
10到15分钟后取组织切成小块再固定
不同动物、不同组织对灌注中压力和速度的要求不同
灌注压力 灌注流量 （mmHg） （毫升/分）
水冷系统： 循环水泵等
电子枪
聚光镜 物镜
投影镜
电子束
样品 光栏 荧光屏
TEM成像和工作原理
电子束投射在样品上，部分电 子直接穿透样品产生透射电子
带有样品信息的透射电子经成 像系统放大，投射到荧光屏上
透射电子多，荧光屏亮；反之
荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与 样品微细结构一一对应，产生具 有一定反差的黑白影像
分辨率（resolution）
表示人眼和光学仪器能够辨别两点 之间最小距离的标志。
两点间的距离越小，表示： 分辨率 ？ 仪器所能分清被观察物体的细节 ？
分辨率是衡量电镜性能的重要指标
分辨率（resolution）
人眼分辨率 光镜分辨率 电镜分辨率
0.2毫米（mm） 0.2微米（µm） 0.2毫微米（nm）
如：肝、脾、肺 1mm3 !
如：胃、肠、皮肤 2mm×1mm2 ！
体内原位固定
（不推荐）
适用于动物实验，将动物麻醉解剖，暴 露所需的组织或器官，立即用预冷的戊 二醛滴到上面直到组织适度变硬，再取 数块组织固定（如脑组织）。
血管灌注固定
将固定液经血液循环灌流到动物体内,把活细 胞在原位及时固定。
血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体 或死亡后缺氧引起自发性的变化影响。
电子束（electron beam）
又称电子射线 电子束带负电荷 具有光的波动性可折射性 电镜利用电子束作为“光源”成像
电子枪
电子与样品作用后产生的 电子信号主要有：
电
子 束
二次电子
透射电子和二次电子
样样本本
透射电子
透射电子（transmission electron）
当样品厚度小于100nm时，部分电子 可穿透样品，将穿透样品的电子叫做 透射电子，利用透射电子信息成像的 称为透射电镜。
放 大 150万倍
80万倍
成 像 透射电子信号成像
二次电子信号成像
样品制备 超薄切片等，过程复杂 较简单，标本可大而厚
图像特点 二维结构，平面图像 三维结构图像，立体感强
应 用 组织细胞内部超微结构 表面及其断面立体形貌
第二节 透射电子显微镜（TEM） Transmission Electron Microscopy
一、TEM结构和工作原理
镜筒
辅助系统
照明系统： 电子枪、聚光镜
成像系统： 样品室、物镜、 中间镜、投影镜
真空系统： 机械泵、油扩 散泵、真空管 道、阀门等
电源系统： 高压电源等
观察记录系统： 观察室、底片室
其他类型: 根据电压分为: 低、中、高压电镜 根据用途分为: 分析电镜、环境电镜
透射电子显微镜－TEM
transmission electron microscopy
扫描电子显微镜－ SEM
Scanning electron microscopy
放大倍率：150万倍 分辨率： 0.1nm
放大倍率：80万倍 分辨率： 0.6nm
肾
120～140
9～10
睾丸
200～220
12～13
肝、胃肠道 160～180
9～10
灌注时一定要注意 压力和速度！
常用的固定剂
预固定： 1.5 % ～5 %戊二醛（0.1M PB配置） 后固定： 1 %锇酸（四氧化锇）水溶液
脱水
目的：指将样品内所含的游离水分完全清除的过程。 (常用的脱水剂为乙醇和丙酮)
二、TEM 的样品制备技术
1. 超薄切片技术 Ultramicrotomy
2. 负染色技术 Negative staining technique
3.免疫电镜技术 Immune Electron Microscopy（IEM）
1. 超薄切片（ultrathin section ）制备技术
超薄切片制备技术 基本操作程序
50% 乙醇 10～15分钟，4℃ 70% 乙醇 10～15分钟，4℃ 80% 乙醇 10～15分钟，4℃ 90% 乙醇 10～15分钟，4℃ 100% 乙醇 10分钟，3次，室温
二次电子（Second electron）
在入射电子的轰击下，样品表面5 ～50nm深度激发出来的电子称为二次电 子，利用二次电子信息成像的称为扫描 电镜。
电镜的基本类型
透射电子显微镜（TEM） Transmission electron microscopy
扫描电子显微镜（SEM） Scanning electron microscopy
取材 脱水 修块
预固定 浸透 切片
后固定 包埋聚合 染色
蜡片
取材
快 在1分钟内固定！ 小 1mm³的小块 轻 不要牵拉、锯、挤压组织 冷 低温操作，4℃保存
为什么？
快 1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为
瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。
小 约1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及
时固定会发生细胞自溶现象。
电子显微镜技术
第一节 电镜的基本理论和分类 第二节 透射电子显微镜 第三节 扫描电子显微镜 第四节 电镜样本的取材
二十世纪最主要的发明之一
55年之后， 1986年获诺贝 尔物理学奖
鲁斯卡(左)和他发明的第一台电镜（1932年）
第一节 电子显微镜的基本理论和分类
电子显微镜镜以电子射线作为照明源， 以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍 率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超 微结构。
轻 不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损
伤。
冷 低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组
织发生自溶。
温度越低越好吗？
－20℃冷冻后
快小
组织未及时固定
轻
牵拉损伤后
轻 血管内皮
预固定
组织块浸泡固定 体内原位固定Biblioteka Baidu 血管灌注固定
常用预固定剂：2 .5% 戊二醛
组织块浸泡固定
取2～3块组织迅速浸泡于固定液中
显微镜的分辨率与波长的关系？（半波长） 光波波长约 0.4 µm，光镜的分辨率？ 电子波长约 0.005 nm，电镜的分辨率？
放大倍率 ＝人眼分辨率÷显微镜分辨率 （magnification）
3.000×
TEM：1000倍～100万倍
50×
SEM：5倍～80万倍
TEM
分辨率 0.1nm
SEM
0.6nm
特别是对脑、心肌、肾脏等对缺 氧比较敏感的组织尤为重要
全身灌注
麻醉后打开胸腔暴露心脏
灌注针头插入左心室
灌注生理盐水后，立即剪开右心房
右心房流出清亮液体， 不含血液时再灌注固定液
10到15分钟后取组织切成小块再固定
不同动物、不同组织对灌注中压力和速度的要求不同
灌注压力 灌注流量 （mmHg） （毫升/分）
水冷系统： 循环水泵等
电子枪
聚光镜 物镜
投影镜
电子束
样品 光栏 荧光屏
TEM成像和工作原理
电子束投射在样品上，部分电 子直接穿透样品产生透射电子
带有样品信息的透射电子经成 像系统放大，投射到荧光屏上
透射电子多，荧光屏亮；反之
荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与 样品微细结构一一对应，产生具 有一定反差的黑白影像
分辨率（resolution）
表示人眼和光学仪器能够辨别两点 之间最小距离的标志。
两点间的距离越小，表示： 分辨率 ？ 仪器所能分清被观察物体的细节 ？
分辨率是衡量电镜性能的重要指标
分辨率（resolution）
人眼分辨率 光镜分辨率 电镜分辨率
0.2毫米（mm） 0.2微米（µm） 0.2毫微米（nm）
如：肝、脾、肺 1mm3 !
如：胃、肠、皮肤 2mm×1mm2 ！
体内原位固定
（不推荐）
适用于动物实验，将动物麻醉解剖，暴 露所需的组织或器官，立即用预冷的戊 二醛滴到上面直到组织适度变硬，再取 数块组织固定（如脑组织）。
血管灌注固定
将固定液经血液循环灌流到动物体内,把活细 胞在原位及时固定。
血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体 或死亡后缺氧引起自发性的变化影响。
电子束（electron beam）
又称电子射线 电子束带负电荷 具有光的波动性可折射性 电镜利用电子束作为“光源”成像
电子枪
电子与样品作用后产生的 电子信号主要有：
电
子 束
二次电子
透射电子和二次电子
样样本本
透射电子
透射电子（transmission electron）
当样品厚度小于100nm时，部分电子 可穿透样品，将穿透样品的电子叫做 透射电子，利用透射电子信息成像的 称为透射电镜。
放 大 150万倍
80万倍
成 像 透射电子信号成像
二次电子信号成像
样品制备 超薄切片等，过程复杂 较简单，标本可大而厚
图像特点 二维结构，平面图像 三维结构图像，立体感强
应 用 组织细胞内部超微结构 表面及其断面立体形貌
第二节 透射电子显微镜（TEM） Transmission Electron Microscopy